北京百奧萊博供應的地高xīn標記探針檢測試劑盒Ⅱ用于科學研究，我公司專注于探針標記及檢測產品的研發、生產和供應，為您提供的地高xīn標記探針檢測試劑盒Ⅱ質量可靠，批間差小，且價格公道，熱切盼望您選購我們的產品。...

特別提示：包括dì高辛標記探針檢測試劑盒Ⅱ(AP)在內，本公司的所有產品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫療及其他非科研用途！

產品名稱：dì高辛標記探針檢測試劑盒Ⅱ(AP)
產品貨號：ZN1517
產品規格：1盒

保存條件：-20℃冰凍保存。
保存期：一年
用途：用于 DNA 探針的隨機引物標記及各種膜上雜交和原位雜交。
工作量：可用于 1000 張切片的原位雜交或12次 10×10cm 膜上雜交檢測。
原理：
所謂 DNA 探針，實質上是一段已知的基因片段，應用這一基因片段即可與待測樣品雜交。如果靶基因和探針的核苷酸序列互補，就可按堿基配對原則進行核酸分子雜交，從而達到檢查樣品基因的目的。在隨機引物法標記反應液中，有隨機合成的六 聚 體 核 昔 酸(hexanucleotide)作 為引 物 ,dATP 、 dCTP 、 dGTP 、 dTTP和D1G-11-dUTP 作為合成底物，以單鏈 DNA 作為模板，在 Klenow 酶的作用下，合成摻入dì高辛的DNA 鏈。以dì高辛標記的探針與靶基因 DNA 鏈雜交后，再通過免疫反應來進行檢測。一般通過酶標抗dì高辛抗體來檢測，就可以肯定雜交反應的存在。
免疫檢測一般用堿性磷酸酶系統，BC1P/NBT 顯色。敏感性很高?？捎糜谀ど想s交和原位雜交。
試劑盒內容：
1．Anti-DIG-AP Conjugate,100μl
2．BCIP/ NBT Stock Solution,1ml
3．Blocking Reagent,5g
特點：
(1)標記屬標記反應。以 1μg DNA 探針為例，1 小時反應即可產生 0.8μg標記探針，20 小時可產生 2μg 左右的標記探針。
(2)試劑將標記反應所需的引物、核苷酸、DIG-11dUTP和 Klenow 酶等混合在一起。一次標記只需吸取一次標記液，使用至為簡便。
(3)標記反應適于下述對象：
a.DNA 從 10ng—3μg。
b.不等的DNA 長度 100bp—10kb。
c.線形排列或呈高度卷曲之 DNA。
d.低融點瓊脂中的DNA。
(4)檢測系統抗體為抗dì高辛單抗，標記堿性磷酸酶。效價 1：5000(膜上雜交)或1：500(原位雜交)。
(5)顯色劑為BCIP/NBT，兩種成分混合后保存于 67%DMF 中，非常穩定。用時 1：50 稀釋。
(6)試劑盒敏感性達到 0.1pg，足夠檢測出 1μg 基因組 DNA 中的單個基因。
(7)除用于各種膜上雜交之外，還可用于原位雜交(ISH)。
操作程序：
一 隨機引物標記操作程序如下：
①用滅菌去離子蒸餾水稀釋 1μg DNA 至總體積 16μl。
②DNA 熱變性：把 DNA 瓶置于沸水中，水浴 10分鐘。然后，迅速地插入碎冰中 3分鐘以上。
③加 4μl DIG Random Labeling Mix(),混勻后再離心 2000/r.p.m×5分鐘。
④置 37℃反應至少 120分鐘。時間越長，產量越高。延長反應時間至 20 小時可明顯增加dì高辛標記DNA的產量。應根據需要控制反應時間。
⑤加入 2μ 1 10mM EDTA 以中止反應，對于原位雜交和膜上雜交反應來說，標記反應可告結束，上述反應液置-20℃保存至少一年以上。且可反復使用。
二 核酸探針膜上雜交原理和操作
(一)雜交總原則
脫氧核苷酸通過磷酸二酯鍵縮合成長鏈構成 DNA的一級結構。兩條堿基互補的多核苷酸鏈按堿基配對原則形成雙螺旋，構成 DNA的二級結構。某些條件(如酸堿、有機溶劑、加熱)可使氫鍵斷裂，DNA 雙鏈打開成單鏈重新結合。所謂雜交，是具有一定互補順序的核酸單鏈，DNA 單鏈仍然可與序列同源的單鏈按堿基互補原則結合成異源性雙鏈的過程。
(二)雜交膜的選擇
雜交膜可以選擇硝酸纖維素膜和尼龍膜。硝酸纖維膜的優點在于本底較低，但只能用于顯色性檢測，且不能用于重復雜交。尼龍膜分為帶正電荷的膜和不帶電荷的膜兩種。帶正電荷的尼龍膜對核酸結合力強，敏感性也較高。不帶電荷的膜結合力低，相應敏感性也較低。尼龍膜的優點在于雜交用過的膜，用洗脫液(0.1×SSC，0.1%SDS)煮沸 5-10分鐘后去除探針，可用于新的探針雜交。如果對雜交結果不滿意，如背景太高或顯色不強，也可洗去探針之后重新雜交。
(三)探針濃度
探針濃度是獲得理想雜交檢測的關鍵因素，濃度太高則會導致本底太深；若濃度太低又會導致信號減弱。為了解決過高探針濃度所引起的高背景，必須進行模擬雜交實驗。
所謂模擬雜交實驗，即選擇幾小片雜交膜，在未轉移 DNA的情況下，進行封閉、不同濃度的探針孵育及隨后的免疫檢測。以背景能被接受的zuì高探針濃度為正式雜交實驗的濃度。模擬雜交實驗不同濃度的探針可以參考下述方法配制：取 5μl 標記反應液加 1ml 探針稀釋液，混勻。取 0.5ml 等倍釋后，再取 0.5ml 繼續等倍稀釋。
假設 20μl 標記反應液中含 1μg 標記的探針，則系列稀釋探針的濃度分別是：
200ng/ml、100nt/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml。
(四)預雜交和雜交液
預雜交和雜交都使用相同緩沖液，不同的僅是預雜交液中不含有探針。下面是幾種基本雜交液配方：
① Standard buffer ：5 × SSC,0.1%(w/v)N-Lauroylsarcosine,0.02%(w/v)SDS,1% Blocking Reagent。
② Standard buffer+50% formamide∶50% formamide(deionized),5×SSC,0.1%(W/V)N-Lauroy lsarcosine,0.02%(w/v)SDS,1% Blocking Reagent。
③ High SDS buffer(Church buffer):7%SDS,50% formamide(deionized),5×SSC,2% Blocking Reagent,50mM Sodiμm Phosphate,0.1% N-Lauroylsarcosine
(五)Southern Blotting 
DNA 片段經電泳分離后按分子量大小排列在瓊脂糖凝膠上。1975 年 Southern 發明了利用濃鹽溶液的推動作用將變性的單鏈 DNA 轉移到硝酸纖維素膜上的方法，解決了原位轉移的問題。雖然其原理和操作均很簡單，卻是基因分析中必不可少的手段，已經得到了廣泛的應用。 Southern 印跡雜交包括兩個主要步驟①把電泳分級的DNA 轉移到固相支持膜上。②與標記的DNA 探針雜交。
1．Southern 轉移
先將 DNA 用限制性內切酶消化。準備一定濃度的瓊脂凝膠。瓊脂凝膠必須是高純度和核酸級的。電泳后經溴化乙錠染色并在紫外燈下照相后，將需要轉移的瓊脂糖凝膠切下，放入搪瓷盤中，然后進行下面的步驟。
試劑
a.0.25M HC1
b.變性液：0.5N NaoH,1.5M Nac1
c.中和液：0.5M Tris-HC1,pH7.4,3M Nac1
d.20×SSC：0.3M 檸檬酸鈉,3M Nac1。
e.2×SSC：0.03M 檸檬酸鈉,0.3M Nac1。
程序：
(1)將膠浸入 0.25M HC1 中 10分鐘。HC1 處理的作用主要是通過去嘌呤使 DNA分子斷裂，因而有利于高分子量 DNA的轉移，但不能處理時間過長。要轉移全部小于 10kb的DNA 片段時可省略此步驟。
(2)進入變性液之前，用蒸餾水漂洗20-30分鐘。
(3)把膠浸入變性液中，室溫浸泡 15分鐘×2次。
(4)蒸餾水漂洗凝膠 2次。
(5)把膠浸入中和液中，室溫泡 15分鐘×2次。
(6)在處理凝膠的同時，切一張與膠同樣大小的尼龍膜或硝酸纖維膜。硝酸纖維膜用 2×SSC 浸泡。
剪兩張 Whatman3#濾紙和一疊吸水用的粗濾紙注意不能用手指直接觸及膜面。
(7)準備轉移用平器和支架，平器中放 20×SSC。架子上搭濾紙橋使溶液能夠虹吸上來。
(8)依次放：處理好的凝膠，硝酸纖維素膜，吸水濾紙，玻璃板，適量重物(500-1000g)
(9)注意：要檢查 PH 值，用硝纖膜時 PH<9。要確保各層間沒有氣泡，否則會發生局部“緣”，氣泡處的DNA 難以被吸到硝酸纖維膜上。
(9)于室溫轉移 12-20 小時。
(10)取出轉移膜，用 2×SSC 漂洗數次，以去掉可能粘附于膜上的凝膠。
(11)固定：可選擇下述方法之一進行 DNA 固定
·紫外線固定：使用長波紫外線照射 10-20分鐘，簡單漂洗后干燥備用。
·尼龍膜置+120℃烘烤 30分鐘。
·硝纖膜置真空烤箱中，80℃減壓烘烤 2-2.5 小時，以避免硝纖膜自熔。若無真空烤箱，
亦可在普通烤箱中 65-70℃烘烤 3-4 小時，也能達到固定目的。固定后，將膜封于塑料袋中，保存于干燥處待雜交。
注意事項：
①轉移液的鹽濃度對轉移具有一定影響。一般選擇 20×SSC 快速轉移。
10×SSC 轉移速度較慢，對于高分子量 DNA(〉10Kb)效果比較理想。因此要根據不同目的選擇適當的轉移液。
②轉移時不能移動上邊重物，防止出現“重影”現象。
③硝酸纖維膜對于 0.5kb 以下的小分子 DNA 結合不牢，轉移時容易丟掉。要探測小片時zuì好用尼龍膜。

2 ．Southern 印跡雜交雜交成功的關鍵因素之一在于選擇雜交液。應通過預實驗來選擇合適的雜交液。另一個比較重要的因素是標記探針的濃度，一般選擇 5-25ng/ml，應通過模擬雜交實驗來選擇合適的探針濃度。
試劑
a.Standard buffer
b.Standard buffer+50% formamide
c.High SDS buffer
d.Wash Solution I:2XSSC,0.1%SDS
e.Wash Solution Ⅱ:0.5XSSC,0.1%SDS
程序
①將轉移好的尼龍膜或硝纖膜裝入塑料袋中，每邊各留 2-4mm 空隙。灌注雜交液的一邊留 1cm 空隙。在角上剪開一個小口，灌注預雜交液，從切口處趕走氣泡，用封膜機封口，浸入水浴中。
②根據所選擇的不同預雜交液，采用不同的溫度預雜交 4-20 小時：Standard buffer:
預雜交溫度 65-68℃ ,Standard buffer+50% formamide:37-42℃ ,High SDS buffer:37-42℃。
③使用雙鏈 DNA 探針時，沸水浴 10分鐘以變性探針。然后迅速插入冰中。
按模擬雜交實驗所確定的探針濃度將適量探針加入到預雜交液中，配成雜交液，一般濃度 5-25ng/ml。按每100cm2 膜加入至少 3.5ml 配制雜交液。
④使用和預雜交相同的雜交溫度，一般雜交 16-20 小時。
⑤雜交結束后，取出雜交袋，剪開一個小口，將雜交液倒入帶蓋的試管中，儲存于-20℃以備下次使用。這樣至少可保存一年。再次使用之前應在凍融之后，加熱至+95℃
10分鐘以變性探針。雜交液如含有 50%甲酰胺，則在 68℃變性 10分鐘即可。
⑥取出雜交膜，用 Wash Solution I洗5分鐘×3次。
⑦保溫沖洗：用 Wash SolutionⅡ于 68℃沖洗15分鐘×2次。
(六)· DNA Dot Blotting 
此檢測方法用于快速定性篩選 DNA。樣品可以是純化 DNA，也可以是細胞碎片 PCR擴的DNA。預雜交和雜交方法與 Southern 基本一致，不同的僅是樣品的處理不同。
試劑：DNA dilution buffer∶10mM Tris-HC1；1mM EDTA,PH8.0；50μg/ml herring Sperm DNA
程序：
①將樣本 DNA 稀釋成不同濃度。
②將樣本 DNA 于+95℃水浴 10分鐘，迅速插入冰中。
③取 1μl 點樣至尼龍膜或硝纖膜上。點樣前先畫上圓卷做記號。
④用紫外線照射固定或+120℃烘烤 30分鐘固定。
其后雜交步驟 Southern 相同
(七)BCIP/NBT 顯色檢測法
試劑：a.Anti-DIG-AP 堿性磷酸酶標記抗dì高辛單抗體。
b.BC1P/NBT 儲備液：
c.沖洗液：0.1M Tris-HC1,0.15M Nac1,PH7.4。
d.封閉液：1% Blocking Reagent/0.1M Tris-HC1,0.15M Nac1。
e.顯色緩沖液：0.1M Tris-Hcl,0.1M,Nacl,PH9.5。
f.TE 緩沖液：10mM Tris,1mM EDTA,PH8.0
程序：
①經過雜交及雜交后的沖洗之后，膜置于沖洗液中平衡 1分鐘。
②用干凈的雜交袋或平皿，封閉液室溫封閉至少 60分鐘。
③用封閉液(d)1：2500—5000 稀釋 Anti-DIG-AP，例如 2μl Anti-DIG-AP 加至 5—10ml封閉液中(根據染色情況而調整)。稀釋液+4℃可穩定 12小時左右。
④加 Anti-DIG-AP，37℃反應 60分鐘。
⑤用沖洗液沖洗15分鐘×3次，每次 100ml。
⑥按 1：50 配制底物顯色液：例如 100μl“BCIP/NBT 儲備液”(b)加至 5ml 顯色緩沖液中，未用完的顯色劑應避光保存。
⑦顯色緩沖液 20ml 平衡 2分鐘后傾掉。
⑧加 10ml 底物顯色液(100 cm2)。將膜及顯色劑封在塑料袋中，開始避光顯色。顯色過程中可以觀察。一般數分鐘即開始出顏色，顯色過程可以持續至 12 小時。應避免振動，以免出現顯色帶的移位。
⑨當所需要的顯色點或帶出現之后，蒸餾水洗以中止反應。結果可以進行照相記錄；也可以直接保存于 TE 緩沖液(f)，在此情況下，顏色長期不退。還有一種選擇是讓膜干燥，顏色消退。但若將膜放置于 TE 緩沖液中，顯色重新出現。
三 原位雜交
所謂原位雜交是指在保存染色體、細胞或組織結構的前提下，用探針定位檢查出相關基因序列。結合免疫細胞化學，原位雜交可以揭示出基因在 DNA、mRNA 水平的表達。
原位雜交技術zuì早 Pardue and Gall和 John etal。分別在 1969 年發現。zuì初，放射性標記技術是的方法，其使用受到明顯限制。由于非放射性標記技術的簡單、高敏感性，為原位雜交技術廣泛應用開避了道路。
(一)染色體原位雜交的一般技術
1 玻片準備
為了展開染色體，酒精清潔玻片即可。但為了防止細胞和組織的脫落，必須用多聚賴氨酸或APES 處理玻片。
2 固定
為了保存形態結構，生物材料都必須予以固定。染色體的固定比較簡單，甲醇/乙酸固定即已足夠。如果是石蠟包埋組織，采用福爾馬林固定。冰凍切片采用 4%甲醛或Bouin"s 固定液固定 30分鐘。應予注意的是，DNA和 RNA 雖然不和各種交聯劑反應。但包圍 DNA.RNA的各種蛋白質和交聯劑反應后，就會遮蓋住靶核苷酸。因此，必須采取各種增加通透性的程序。
3 玻片上材料的預處理
a．內源性酶的滅活
如果用酶作為標記物，內源性酶必須預先予滅活。如過氧化物酶，可用 1%H2O2/甲醇 30分鐘處理。至于堿性磷酸酶，由于雜交過程的破壞，殘余堿性磷酸酶的活力會完全消失。
b.RNA 酶的處理—DNA-DNA 雜交時需要處理內源性 RNA。
內源性 RNA的存在，會由于 DNA-RNA的雜交而增加背景。處理方法：DNase-free RAase(100μg/ml)/2×SSC,37℃孵育60分鐘。(SSC=150mM Nac1,15mM Sodiμm Citrate,PH7.4)
c.HC1處理用 200mM HC1處理 20-30分鐘可以增加信/噪比值，其機理尚不清楚。
可能與蛋白的抽提和部分功能核苷酸片斷的溶解有關。
d.去垢劑處理
在脂膜成分未被固定，脫水、包埋等程序抽提時，可以進一步使用去垢劑處理，如Triton X-100,Sodiμm dodecyl Sulfate 等，同樣有助于原位雜交技術。
e.蛋白酶消化
蛋白酶消化有助于增進探針和核苷酸之間的接觸性。消化通常用蛋白酶K，溶于20mM Tris-HC1,2mM Cac12，PH7.4 ,37℃ 15-30分鐘。蛋白酶 K 濃度依不同對象來確定。
例如對染色體和核的分離部分，可以用 1μg/ml 蛋白酶 K。
4 探針和靶基因的變性
對染色體 DNA的原位雜交，必需進行變性處理。熱變性越來越常用，它不僅簡單，而且效果很好。對不同的雜交，應試驗不同的時間和溫度，以找到zuì佳的變性條件。
熱變性時，探針和靶基因可以同時變性。將探針加到玻片上，蓋上蓋玻片。玻片放到 80℃，2分鐘后取出冷卻至 37℃。如果是組織切片，變性時間應達到 80℃10分鐘
5 雜交后的沖洗
標記探針能夠和其序列具有部分同源性的基因非特異性的雜交。這類雜交分子的穩定性總是不及完全同源的雜交分子。分別用不同強度沖洗液可以有效地洗掉非特異雜交的/探針，而保留特異雜交的探針。沖洗液的強度可通過改變甲酰胺濃度、鹽濃度和溫度來控制。通常用 2×SSC＋50%甲酰胺來沖洗。有時可用更高強度的沖洗液。
總的來說，雜交時用高強度緩沖液，沖洗時用低強度的沖洗液(鹽濃度越低，甲酰胺濃度越高和溫度越高，則沖洗強度越大)。
6 免疫細胞化學
免疫細胞化學和常規方法一樣，必須行非特異性的封閉處理。如探針為dì高辛標記時，Tris-HC1 緩沖液含“Blocking Reagent”。此外 0.4M NaCl的加入也有助于降低背景。在標準的免疫反應程序中，先對染色體、細胞和組織進行封閉，然后用酶標抗體 37℃反應 30分鐘(或室溫 1-2 小時)。此后用含 Tween 20的緩沖液進行三次沖洗每次 5-10分鐘。免疫細胞化學中zuì常用的酶是過氧化物酶和堿性磷酸酶。
前者用 DAB 作顯色劑。后者用 BCIP/NBT 作顯色劑，方法同膜上雜交。顯色強度由顯微鏡下控制。
7 影響原位雜交的主要因素
a.探針長度：原位雜交和其它雜交方法不同，它要求較短的探針。因為探針越短，滲透性越強，可以滲透至細胞內部和染色體。不同的雜交所允許的zuì小核苷酸如下述公式所計算：
b.探針濃度：濃度越高，則雜交速度越快。但過高的濃度也會使背景增加，因此，宜選擇可接受背景的zuì高探針濃度。
c.硫酸萄聚糖：在水溶液中，硫酸萄聚糖是高度水化物質，因此使得大分子(如探針)難以接觸到其結合水，相對濃度大大增加，雜交速度明顯加快。
d.堿基錯配：堿基錯配會引起雜交速度及二倍體的穩定性下降。因此在嚴格的雜交條件下，可以阻止探針與靶基因的非特異結合。
e.沖洗條件
8 雜交標準條件
適于 DNA 探針＞100bp
⊙50%去離子甲酰胺
⊙2×SSC
⊙50mM NaH2PO4/Na2HPO4,PH7.0
⊙1mM EDTA
⊙載體 DNA：鮭角精子 DNA 100-250ng/μl。
任選組合：
1×Denhardt`s
dextran sulfate,1-10%
溫度 37-42℃
雜交時間：5-16 小時
(二)組織切片的原位雜交
目前，原位雜交已成病理學的一個有力工具，原位雜交可以用于諸如病毒，癌基因，基因突變等領域的檢查。尤其是非放射性標記探針技術，為更多的實驗室廣泛應用原位雜交創造了條件。對福爾馬林固定、石蠟包埋切片的原位雜交，關鍵是以下三個步驟：
①靶 DNA的暴露。這要靠精心設計的消化步驟。
②DNA的變性和雜交。
③雜交的分子的沖洗和檢測。
1 探針的準備
2 玻片的處理
①去污劑浸泡一晚，大量自來水沖洗，然后用蒸留水清洗。
②干燥之后，浸入丙酮中 3分鐘。
③玻片移入 1：50 丙酮稀釋的APES 溶液中，浸泡 5分鐘。
④玻片用蒸餾水略加清洗。干燥備用。處理后的玻片置干燥無塵環境可保存半年。
玻片也可用“多聚賴氨酸”處理。
3 組織切片的準備
①組織用常規 4%中性緩沖甲醛溶液固定，石蠟包埋。
②常規切片。切片撈于涂有粘片劑的玻片上。
③切片處理：先置 60℃烘片 30分鐘。
二甲苯脫蠟，逐級酒精至水清洗。
④臨用前配制蛋白酶 K 溶液：
儲備液：Proteinase K,10mg/ml H2O，小量分袋-20℃保存。將儲備液用 TES 稀釋成100μg/ml。(TES=5mM Tris-HC1,10mM EDTA,10mM Nac1,PH7.4)
⑤每張切片用 Proteinase k 20-30μl 37℃消化 15分鐘。消化過程中加蓋硅化蓋玻片，并置濕盒中。注意消化對組織原位雜交是至關重要的。過度消化會導致切片消失殆盡，消化不足則敏感性不夠，因此應針對不同組織嘗試不同的消化條件。
4 雜交
①蛋白 K 消化后，去除蓋玻片。用 4%甲醛 4℃固定 5分鐘。
②蒸餾水洗5分鐘。
③讓切片上水分滴下去，并在室溫干燥 5分鐘。注意只能讓切片上水份減少，不能讓切片完全干燥。④每張切片加 5-10μl 探針(大切片需相應增加)。
⑤設立嚴格的對照組，每張切片加 5-10μl不加探針的雜交液。
⑥切片上加硅化蓋玻片，將玻片置+95℃變性6分鐘。
⑦把玻片放到冰上 1分鐘。
⑧切片置溫盒，42℃雜交3小時以上。如果方便，應雜交過夜。
5 沖洗
去掉蓋玻片，按下述程序沖洗
2×SSC洗5分鐘×2次(室溫)
0．1×SSC洗10分鐘(42℃)
6 雜交分子的檢測---BCIP/NBT
①切片置于 0．1M TBS 緩沖液中，PH7．4
②每張切片加 20-40μl 封閉液：0．5%Blocking Reagont/0.1M TBS。
③室溫反應 15分鐘。
⑤用封閉液 1：500 稀釋 Anti-DIG-AP；(臨用之前才配，配好后立即加至切片)
⑥每張切片加 20-50μl 稀釋試劑，濕盒室溫反應 1-2 小時。
⑦用 0．1M TBS洗10分鐘×3次
⑧用 0．2M Tris-HC1,10mM MgC12,PH9.2 平衡5分鐘。
⑨配顯色劑：將 BCIP/NBT 儲備液用上述緩沖液 1：50稀釋。每張切片加20μl，置黑暗處顯色。顯色快時，一般30-60分鐘。信號弱時顯色過夜。
(三)細胞的原位雜交
下面的程序是用標記DNA 探針來檢測培養細胞中的mRNA。其它類型的檢測可以參照此程序進行。
1 細胞準備，固定和增加通透性
注意：所有溶液都必須用 RNase 抑制劑處理。
①玻片用多聚賴氨酸處理。直接用 5% CO2 在玻片上培養細胞。所用培養基為無酚紅 Dulbecco"s 基礎培養基。
②37℃PBS 清洗細胞。然后用下述固定液室溫固定 30分鐘：4%甲醛，5%乙酸和0．9%NaC1。③室溫 PBS 清洗固定細胞，用 70%乙醇儲存于 4℃④雜交前用下述方法脫水：
70%，90%和 乙醇；10%二甲苯；然后再用 ，90%，70%乙醇，zuì后 PBS洗二次。
⑤用胃蛋白酶消化細胞：0.1%Pepsin/0.1N HC1,37℃5-10分鐘。
⑥PBS洗5分鐘后，1%甲醛固定 10分鐘。PBS洗。
2 雜交
①dì高辛標記探針。
②雜交液配制：60%去離心甲酰胺，0．3M NaC1，30mM檸檬酸三鈉，10mM EDTA，25mM Na2HPO4(PH7.4)，5%硫酸萄聚糖，250ng/μl鮭角精子 DNA。
③于80℃10分鐘變性標記探針，然后加至上述雜交液中，濃度為5ng/μl
④加 10μl雜交液至玻片上，并蓋上蓋玻片。注意：也可選擇原位變性步驟，這樣可增加 RNA和探針的接觸性。
⑤37℃雜交16小時。
3洗滌
雜交后去掉蓋玻片，于下述溶液中充分洗滌：60%甲酰胺，300mM NaCl，30mM 檸檬酸鈉。室溫洗三次，37℃洗一次。然后 PBS洗5分鐘。
4 免疫檢測
①用下述緩沖液作非特異性的封閉：0．5%Blocking Reagent/0.1M TBS，加蓋玻片。
室溫 15分鐘。②用封閉液 1：500 稀釋 Anti-DIG-AP(臨用之前才配，配好后立即加至切片)。
③每張切片加 20-50μl 稀釋酶標試劑，置濕盒室溫反應 1-2小時。
④用 0．1M TBS洗10分鐘×3次。
⑤用 0．1M Tris-HC1．0．1M Nac1，50mM Mgc12，PH9.5 平衡約 5分鐘。
⑥顯色劑配制：將 BC1P/NBT 儲備液用上述緩沖液 1：50 稀釋。每張切片加 20μl，置黑暗處顯色，一般顯色 30-60分鐘。信號弱時顯色過夜。

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名稱：生物素標記dUTP溶液(Biotin-11-dUTP)
貨號：BTN100920
規格：50μL
本產品是濃度為1mM的Biotin-11-dUTP。分子式：C28H41N6O17P3SNa3，分子量：927.6。分子結構式圖如下：

Biotin-11-dUTP常用于PCR、缺口平移、cDNA合成、隨機引物標記和引物延伸等方法標記DNA。

儲存條件：低溫運輸，-20℃保存，有效期兩年。

名稱：生物素標記UTP溶液(Biotin-16-UTP )
貨號：BTN151203
規格：25μL

名稱：BLOTTO溶液
貨號：BTN100812
規格：250mL
BLOTTO全名是Bovine Lacto TransferTechnique Optimizer，是一種含有脫脂奶粉、磷酸鹽和抗菌劑的雜交阻斷劑，可以用于DNA雜交(Southern雜交、斑點雜交、菌落雜交)、Western雜交、ELISA；但不能用于RNA雜交和低拷貝的Southern雜交。也不能與含高濃度的SDS混用。

儲存條件：低溫運輸、-4℃保存(不能保存在-20℃)，有效期一年。

名稱：鮭魚精DNA溶液
貨號：BTN100604
規格：1mL
本產品是濃度為10mg/mL的、經過熱變性處理的單鏈鮭魚精DNA溶液，可以用于Southern、Northern預雜交，還可以用于酵母化學轉化和電轉化。本產品即開即用，非常方便。

儲存條件：低溫運輸和-20℃保存、有效期一年。

名稱：化學發光法生物素標記核酸檢測試劑盒
貨號：YT032
規格：1000cm2
本試劑盒是一種通過Streptavidin-HRP及后續的ECL試劑來實現化學發光檢測Biotin標記核酸的檢測試劑盒。適用于Southern blot、Northern blot、ribonuclease protection assay (RPA)或EMSA等實驗中，采用生物素標記的DNA或RNA探針時的檢測。本試劑盒不適用于生物素標記蛋白的檢測。

本試劑盒采用了高質量的Streptavidin-HRP Conjugate，HRP和Streptavidin共價交聯的比例大于3，這樣比采用Streptavidin和Biotin-HRP conjugate兩種試劑進行檢測要更方便，并且靈敏度更高。采用了非特異性結合比avidin更低的strepatavidin，使檢測結果背景更低靈敏度更高。

本試劑盒沒有提供生物素探針標記相關的試劑，生物素標記的DNA探針或EMSA探針的制備可以相應地使用百奧萊博的生物素標記DNA試劑盒（TdT加尾法）或EMSA探針生物素標記試劑盒(YT189)。本試劑盒可以用于檢測至少10塊10 x 10cm有生物素標記EMSA探針的膜，即共1000cm2。

試劑盒組份：

ECL A液	55ml
ECL B液	55ml
Streptavidin-HRP Conjugate	100μl
封閉液	380ml
洗滌液(5X)	250ml
檢測平衡液	250ml

儲存條件：-20℃。

使用說明：
1. 在使用Biotin標記探針的情況下，完成Southern、Northern雜交及后續洗滌后，或RPA的轉膜和交聯后，或EMSA的轉膜和交聯后，可以使用本試劑盒開始檢測。下面的檢測過程中溶液的用量是用于一片10x10cm膜的量。如果膜較大或較小，各溶液的用量可以按比例放大或縮小。
2. 37-50oC水浴溶解封閉液和洗滌液。
注意：封閉液和洗滌液必須完全溶解后方可使用，封閉液和洗滌液可以在室溫至50oC之間使用，但必須確保這兩種溶液中均無沉淀產生，在冬天需特別注意。
3. 取一合適的容器加入15ml封閉液，再放入交聯過的含有樣品的尼龍膜。在側擺搖床或水平搖床上緩慢搖動15分鐘。
4. 取7.5μl Streptavidin-HRP Conjugate加入到15ml封閉液中(1:2000稀釋)，混勻備用。
5. 去除封閉液，加入上一步中配制的15ml含有Streptavidin-HRP Conjugate的封閉液。在側擺搖床或水平搖床上緩慢搖動15分鐘。
6. 取25ml 洗滌液(5X)，加入100ml重蒸水或MilliQ級純水，混勻配制成125ml洗滌液。
7. 將尼龍膜轉移至另一裝有15-20ml洗滌液的容器內，漂洗1分鐘。
8. 去除洗滌液，加入15-20ml洗滌液，在側擺搖床或水平搖床緩慢上洗滌5分鐘。
9. 重復步驟8三次(共洗滌四次)，每次洗滌時間均約為5分鐘。
10. 將尼龍膜轉移至另一裝有20-25ml檢測平衡液的容器內，在側擺搖床或水平搖床上緩慢搖動5分鐘。
11. 取5ml ECL A液和5ml ECL B液混勻，配制成ECL工作液。注意：ECL工作液必須現配現用。說明：從本步驟起操作方法和注意事項同Western實驗的熒光檢測。
12. 取出尼龍膜，用吸水紙吸去過多液體。立即將膜的樣品面向上，放置到處于水平桌面上的潔凈容器內或保鮮膜上。
13. 在尼龍膜的表面小心加上步驟11配制好的共10ml ECL工作液，使工作液完全覆蓋尼龍膜。室溫放置2-3分鐘。
14. 取出尼龍膜，用吸水紙吸去過多液體。將尼龍膜放在兩片保鮮膜或其它適當的透光薄膜中間，并固定于壓片暗盒(也稱片夾)內。
15. 用X光片壓片1-5分鐘?？梢韵葔浩?分鐘，立即顯影定影，然后根據結果再調整壓片時間；也可以直接分別壓片30秒、1、3、5分鐘或更長時間，然后一起顯影定影觀察結果。

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