耐熱逆轉錄酶II由北京百奧萊博供貨并提供相關技術服務支持，本品用于科研目的，我公司的耐熱逆轉錄酶II品質上佳，經過多年的開發(fā)生產，已然非常成熟，歡迎廣大新老客戶訂購。...

特別提示：包括耐熱逆轉錄酶II在內，本公司的所有產品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產品名稱：耐熱逆轉錄酶II
英文名稱：Reverse Transcriptase II
產品貨號：SY0294
產品規(guī)格：2000U

Reverse Transcriptase（第二代耐熱逆轉錄酶）是Reverse Transcriptase（代耐熱逆轉錄）的升級產品，是在M-MLV (RNase H-) Reverse Transcriptase基礎上通過體外分子進化技術獲得的全新耐熱逆轉錄酶。與上一代相比，進一步大幅提高了熱穩(wěn)定性，50℃下半衰期超過240min，并長時間耐受55℃高溫且保持穩(wěn)定，非常適合具有復雜二級結構的RNA模板的逆轉錄。此外，增加了多個突變位點，進一步增強了模板親和力和行進性，大幅提升全長cDNA的合成能力，可獲得長達20 kb的cDNA。另外，對于常見的逆轉錄抑制物具有更高的耐受度，非常適合于植物組織RNA的逆轉錄反應。

活性定義：以Poly(rA) Oligo(dT)為模板/引物，在37℃，10min內，摻入1 nmol的dTTP為酸不性溶物質所需要酶量定義為1個活性單位（U）。

質量控制
核酸外切酶殘留檢測：200 U本品和0.6 μg λ-Hind Ⅲ在37 oC下孵育1h，DNA的電泳譜帶不發(fā)生變化。
核酸內切酶殘留檢測：200 U本品和0.6 μg Supercoiled pBR322 DNA在37 oC下孵育1h，DNA的電泳譜帶不發(fā)生變化。
RNase殘留檢測：200 U本品和1 μg小鼠肝臟總RNA在37 oC下孵育1h，RNA電泳譜帶不發(fā)生變化。
功能檢測1：逆轉錄體系中加入200 U本品，以100 pg Hela cell total RNA為模板，Oligo(dT)23為引物，50 oC反應30min。取10% cDNA產物進行PCR擴增β-actin基因。瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，可見有單一的550 bp條帶。
功能檢測2：逆轉錄體系中加入200 U本品，以500 ng Hela cell total RNA為模板，Oligo(dT)23為引物，55 oC反應45min。取10% cDNA產物進行PCR擴增Polε基因。瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，可見有單一的4.8 kb (GC-rich)條帶。
功能檢測3：逆轉錄體系中加入200 U本品，以1 pg-1 μg Hela cell total RNA為模板，Oligo(dT)23VN和Random Hexamers為引物，測試qRT-PCR 性能。以6個數量級的模板量的對數值對Ct值做標準曲線，R2>0.990，斜率在-3.20到-3.60之間。

準備工作
1. 防止RNase污染：請保持實驗區(qū)域潔凈；操作時需穿戴干凈的手套、口罩；實驗所用的離心管、槍頭等耗材均需保證RNase free。
2. 引物選擇：
2.1 后續(xù)實驗為PCR
a, 如果模板為真核生物來源，一般情況下選Oligo dT18，與真核生物mRNA的3’Poly A尾配對，可獲得zuì高產量的全長cDNA。
b, 基因特異性引物 (GSP)的特異性zuì高。但有些情況下，用于PCR反應的GSP無法有效引導鏈cDNA合成。這時，可改用Oligo dT18或Random hexamers重新進行逆轉錄。
c, Random hexamers特異性zuì低，所有RNA，包括mRNA, rRNA, tRNA均可以作為Random hexamers的模板。當目標區(qū)域具有復雜二級結構或GC含量較高，或者模板為原核生物來源，使用Oligo dT18或基因特異性引物 (GSP)無法有效引導cDNA合成時，可使用Random hexamers為引物。
2.2 后續(xù)實驗為qPCR
a, 將Oligo dT18與Random hexamers混合使用，可使mRNA的各個區(qū)域均能以相同效率引發(fā)cDNA合成，有助于提高定量結果的重復性。

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