SNP基因分型PCR試劑（探針法由北京百奧萊博供貨并提供相關(guān)技術(shù)服務(wù)支持，本品用于生化實驗研究等領(lǐng)域，本品質(zhì)量穩(wěn)定，價位合理，需要SNP基因分型PCR試劑（探針法等核酸擴增(PCR)產(chǎn)品的客戶，請到我公司官網(wǎng)聯(lián)系我們。...

特別提示：包括SNP基因分型PCR試劑（探針法)在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：SNP基因分型PCR試劑（探針法)
英文名稱：BaiExact Genotyping qPCR PreMix（Probe)
產(chǎn)品貨號：WH0109
產(chǎn)品規(guī)格：125次|500次

本制品是一款專門應(yīng)用于探針法SNP檢測的即用型2×濃度的熱啟動PCR預(yù)混試劑。該預(yù)混試劑含有特異的抗體修飾Taq DNA聚合酶，能有效檢測低豐度的DNA模板。精心配制的獨特PCR緩沖液能有效消除眾多PCR抑制劑對PCR的抑制及對熒光信號淬滅的影響，對SNP鑒定有很好的特異性和擴增效率。

產(chǎn)品特點：
1．防彈式基因分型---輕松屏蔽PCR抑制劑對SNP分型的影響。
2．快速反應(yīng)----對多數(shù)實驗?zāi)軌驁?zhí)行快速PCR操作。
3．熒光信號強----強勁的SNP分型僅需少量的引物探針。
4．避免操作失誤----添加藍色指示染料，監(jiān)控實驗添加過程。

試劑盒原理：
本制品適用于水解探針法進行模板的熒光定量PCR和SNP檢測，該產(chǎn)品可以克服PCR反應(yīng)液中的抑制因子，特別是對粗提樣本，其表現(xiàn)出高度的抗逆性。適用于植物，動物，以及一些環(huán)境樣本的粗提液。

2×BaiExact Genotyping PreMix（Probe)中特異的抗體修飾熱啟動Taq DNA聚合酶，95℃條件下僅需2~5分鐘即可激活全部酶活，減少了反應(yīng)時間，同時大限度的減少PCR擴增全程中的非特異性擴增，配合精心優(yōu)化的buffer體系，使該產(chǎn)品對于序列變異的鑒定有很好的特異性和擴增效率。

2×BaiExact Genotyping PreMix（Probe)包含dNTPs，增強劑，穩(wěn)定劑等以提高產(chǎn)物特異性和反應(yīng)靈敏度，并包含一種微藍色的指示染料，該染料對PCR反應(yīng)以及探針熒光沒有任何影響；使操作更加方便，避免大量樣本小體系（10μl體系）操作過程中容易產(chǎn)生的加樣錯誤。

試劑盒組成：

組分	20μl×125次	20μl×500次
2× BaiExact Genotyping PreMix（Probe)	1.25ml	4×1.25ml
50×ROX Reference Dye	250 μl	1ml
RNase-Free ddH2O	2×1ml	5×1ml

儲存條件：收到本產(chǎn)品后，請立即置于-20℃避光保存，在該條件下避光可保存2年。從-20℃取出使用時，將凍存的2× BaiExact Genotyping qPCR PreMix（Probe)和50×ROX Reference Dye溶解，然后輕輕顛倒混勻，待溶液完全均一后再行使用。如解凍后沒有使用，須徹底混勻后重新冷凍（在解凍過程中鹽會出現(xiàn)分層現(xiàn)象，未混勻進行冷凍，鹽晶體的析出將會對酶造成損害)。如需一段時間內(nèi)經(jīng)常取用，可在2～8℃條件下儲存3個月。避免反復(fù)多次凍融。

注意事項：請務(wù)必在使用本試劑盒之前閱讀此注意事項。
1．如果試劑沒有混勻，其反應(yīng)性能會有所下降。使用時請上下顛倒輕輕混勻，請不要使用振蕩器進行混勻，盡量避免出現(xiàn)泡沫，并經(jīng)瞬時離心后使用。
2．本產(chǎn)品中不含有熒光探針。
3．引物終濃度為300 nM，探針終濃度為200 nM可以在大多數(shù)體系中獲得良好的擴增結(jié)果。需要進一步優(yōu)化引物濃度的，可以在100-900 nM范圍內(nèi)調(diào)整；需要進一步優(yōu)化探針濃度的，可以在100-250 nM范圍內(nèi)調(diào)整。
4．20 μl反應(yīng)體系中，基因組DNA模板的使用量一般小于100ng。

操作步驟：

一、建立Real-Time PCR反應(yīng)體系：
1．溶解2× BaiExact Genotyping PreMix （如果保存在-20℃)，50×ROX Reference Dye，模板，引物、探針和RNase-Free ddH2O，并將所有試劑在室溫下平衡并徹底混勻。
2.建議置于冰上進行Real-Time PCR反應(yīng)液的配制。反應(yīng)體系如下：

成分	使用量（20μl體系)	終濃度
2× BaiExact Genotyping PreMix（Probe)	10μl	1×
正向引物（10μM）①	0.6μl	0.1～0.9μM
反向引物（10μM）①	0.6μl	0.1～0.9μM
探針（10μM）②	0.4μl	0.1～0.25μM
模板	2μl	-
50×ROX Reference Dye③	-	-
RNase-Free ddH2O	至20μl	-

①引物終濃度為0.3 μM可以在大多數(shù)體系中獲得良好的擴增結(jié)果。擴增效率不高時，可增加PCR反應(yīng)體系中的引物濃度；發(fā)生非特異擴增時，可適當減少PCR反應(yīng)體系中的引物濃度。需要進一步優(yōu)化引物濃度的，可以在0.1-0.9 μM范圍內(nèi)調(diào)整。
②探針的濃度與使用的Real-Time PCR擴增儀、探針種類、熒光標記物質(zhì)種類有關(guān)，實際使用時請參照儀器說明書，或各熒光探針的具體使用說明進行。通常探針終濃度為0.2 μM可以在大多數(shù)體系中獲得良好的擴增結(jié)果。需要進一步優(yōu)化探針濃度的，可以在0.1-0.25 μM范圍內(nèi)調(diào)整。
③幾種常見儀器的zuì適ROX Reference Dye濃度如下：
  ABI PRISM 7000/7300/7700/7900HT/Step One等：5×（例如：5μl ROX/50μl體系)；
  ABI 7500、7500 Fast；Stratagene Mx3000P、Mx3005P和Mx4000等：1×（例如：1μl ROX/50μl體系)；
  Roche儀器，Bio-Rad儀器，Eppendorf儀器等：無需添加。
3.蓋上反應(yīng)管，輕柔混勻。可短暫離心，確保所有組分均在管底。
4.將反應(yīng)體系置于熒光定量PCR儀中，開始反應(yīng)。

二、進行Real time PCR反應(yīng)：
建議采用兩步法PCR反應(yīng)程序進行反應(yīng)；若模板量較低等因素導(dǎo)致擴增效果不佳，可使用三步法程序進行PCR反應(yīng)。

兩步法反應(yīng)程序：

階段	循環(huán)	溫度	時間	內(nèi)容	熒光信號采集
預(yù)變性	1×	95℃	2min④	預(yù)變性	否
PCR反應(yīng)	40×	95℃	15sec	變性	否
		60℃	30sec⑤	退火/延伸	是

三步法反應(yīng)程序：

階段	循環(huán)	溫度	時間	內(nèi)容	熒光信號采集
預(yù)變性	1×	95℃	5min④	預(yù)變性	否
PCR反應(yīng)	40×	95℃	15sec	變性	否
		50-60℃	15sec	退火	否
		72℃	30sec⑤	延伸	是

④解鏈時間的長短與模板的長度和GC含量有關(guān)。
⑤使用不同型號儀器進行時間設(shè)定時，請按照儀器使用說明書要求進行實驗操作，幾種常見儀器的時間設(shè)定見下表：
  使用Roche，ABI 7500 Fast，BioRad和Agilent等公司熒光定量PCR儀時請設(shè)定在15sec。
  使用ABI 7900HT/7900HT Fast/ViiA 7/StepOne/StepOnePlus時請設(shè)定在20 sec。
  使用ABI 7000和7300時請設(shè)定在31 sec。
  使用ABI7500時請設(shè)定在32 sec。

常見問題：

1．低濃度模板時擴增曲線混亂，熒光強度變?nèi)?br />

原因	解決辦法
目標DNA的拷貝數(shù)過少	反應(yīng)液中的目標DNA拷貝數(shù)只有幾倍到幾十倍時，拷貝數(shù)散亂的概率變大，容易形成線性混亂。請適當提高樣品濃度再進行反應(yīng)。
與引物二聚體發(fā)生競爭	目的片段擴增的同時出現(xiàn)引物二聚體的擴增，由于競爭使目的片段的擴增反應(yīng)變?nèi)酢Ｕ埫鞣磻?yīng)條件或重新設(shè)計引物，以防止引物二聚體的形成。
DNA被反應(yīng)離心管吸附而損失	模板濃度較低或樣品稀釋后長時間存放時，會導(dǎo)致DNA被反應(yīng)離心管吸附而損失。請?zhí)岣邩悠窛舛仍龠M行反應(yīng)。如果對樣品進行稀釋，建議稀釋后立即進行反應(yīng)。

2．重現(xiàn)性差

原因	解決辦法
儀器方面的故障	因為儀器的不適用，在溫度管理或檢測時產(chǎn)生重現(xiàn)性差。請根據(jù)相應(yīng)儀器的說明書進行點檢。
樣品純度不好	不純的樣品會導(dǎo)致實驗的重現(xiàn)性差。
稀釋的模板放置太久	濃度較低的DNA溶液存放時間較長時，由于被管壁吸附從而實際濃度會更低，建議從原液重新稀釋后再進行反應(yīng)。另外，通過梯度稀釋的標準樣品zuì好每次使用時直接從原液稀釋。
引物或探針質(zhì)量下降	盡量避免新合成引物批次間的差異，可以使用原來質(zhì)量好的引物做為對照。
PCR反應(yīng)條件、引物濃度、序列等不恰當	擴增效率差的PCR較容易產(chǎn)生重現(xiàn)性差。通過變更引物和探針的濃度或PCR反應(yīng)條件來進行調(diào)整。擴增不好時，一般可降低退火溫度或提高引物濃度，也可以延長延伸時間。如模板的GC含量較高，可延長變性時間。仍得不到改善時，建議重新設(shè)計引物和探針。
計量誤差	反應(yīng)體積太小會導(dǎo)致檢測精度下降。請根據(jù)定量PCR儀推薦的反應(yīng)體積重新實驗。

3．NTC可見擴增

原因	解決辦法
發(fā)生交叉污染	請更換新的試劑或滅菌水。仍無法得到改善時，請嘗試到新的實驗環(huán)境進行操作。
儀器設(shè)定誤差（多重PCR）	當使用幾種熒光探針時，請正確設(shè)定熒光測定，防止出現(xiàn)因不同染料的光譜交叉而導(dǎo)致的檢測信號差異。

4．擴增曲線熒光信號很弱，或擴增曲線呈鋸齒狀

原因	解決辦法
檢測光光譜設(shè)定誤差	由于目前不同熒光定量PCR儀的原理和提供的檢測光光譜范圍的差異，因此在選擇探針的發(fā)光基團和淬滅基團時一定要根據(jù)所用的儀器型號設(shè)置的可檢測的熒光信號范圍內(nèi)選擇。請參照儀器的使用說明書，重新確定參數(shù)設(shè)置。
熒光探針純度太低	請使用HPLC級別以上純化的Probe，否則殘留的未結(jié)合的熒光染料會造成基線上飄，從而導(dǎo)致擴增產(chǎn)物所產(chǎn)生的熒光值變低。
熒光探針質(zhì)量較差	由于探針保存中分解導(dǎo)致基線上飄，從而導(dǎo)致擴增產(chǎn)物所產(chǎn)生的熒光值變低。此外，一部分熒光染料不適合含有EDTA的buffer進行保存。請按照Probe合成公司推薦的保存條件。
熒光采集時間太短	對部分儀器，需要更長的延伸時間來充分采集熒光。擴增曲線鋸齒狀較明顯時，將延伸時間設(shè)定為45-60 sec可得到改善。

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名稱：2×BAmp MasterMix(含染料)
貨號：WE0106
規(guī)格：5ml
  BAmp MasterMix由BAmp DNA Polymerase、PCR Buffer、Mg2+、dNTPs以及PCR穩(wěn)定劑和增強劑組成的預(yù)混體系，濃度為2×。BAmp DNA Polymerase是一種兼具高擴增效率和高保真性的耐熱聚合酶。其主要特點是可以擴增長片段DNA，尤其在擴增>10 kb的DNA片段方面，其更加明顯，所擴增的片段zuì長可以達到40 kb。該酶具有高度的延伸和校對能力，保真度高于普通Taq酶。預(yù)配好的PCR混合液使操作更加簡單快捷，可zuì大限度地減少人為誤差和污染。的MasterMix配方使整個反應(yīng)體系非常穩(wěn)定，重復(fù)性好。本產(chǎn)品已加入染料(藍色)，反應(yīng)結(jié)束后可直接進行電泳檢測，無需再使用上樣緩沖液。擴增得到的PCR產(chǎn)物3"端附有一個“A”堿基，因此可直接用于T/A克隆。適用于構(gòu)建基因圖譜、序列測定及分子遺傳學(xué)研究等。

產(chǎn)品組成：

組份	1ml	5ml
2×BAmp MasterMix(With Dye)	1ml	5×1ml
ddH2O	1ml	5×1ml

注意：2×BAmp MasterMix含有BAmp DNA Polymerase,3 mM MgCl2 和400μM each dNTP。

質(zhì)量控制：
1、經(jīng)檢驗無外源核酸酶活性；
2、PCR方法檢測無宿主殘余DNA；
3、能有效地擴增多種基因組中的單拷貝基因。

使用方法：
以下舉例為以人基因組DNA為模板，擴增1 kb的片段的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，實際操作中應(yīng)根據(jù)模板、引物結(jié)構(gòu)和目的片段大小不同進行相應(yīng)的改進和優(yōu)化。

1、PCR反應(yīng)體系

試劑	50μl反應(yīng)體系	終濃度
2×BAmp MasterMix(With Dye)	25μl	1×
Forward Primer，10μM	2μl	0.4μM
Reverse Primer，10μM	2μl	0.4μM
Template DNA	<0.5μg	<0.5μg/50μl
ddH2O	up to 50μl

注意：引物濃度請以終濃度0.1-1.0μM作為設(shè)定范圍的參考。擴增效率不高的情況下，可提高引物的濃度；發(fā)生非特異性反應(yīng)時，可降低引物濃度，由此優(yōu)化反應(yīng)體系。

2、PCR反應(yīng)條件

步驟	溫度	時間	循環(huán)數(shù)
預(yù)變性	94℃	2 min
變性	94℃	30 s	25-35 個循環(huán)
退火	55-65℃	30 s
延伸	72℃	30 s
終延伸	72℃	5 min

注意：
1)一般實驗中退火溫度比擴增引物的熔解溫度Tm低5℃，無法得到理想的擴增效率時，適當降低退火溫度；發(fā)生非特異性反應(yīng)時，提高退火溫度，由此優(yōu)化反應(yīng)條件。
2)延伸時間應(yīng)根據(jù)所擴增片段大小設(shè)定，BAmp DNA Polymerase的擴增效率為2.0 kb/min。
3)可根據(jù)擴增產(chǎn)物的下游應(yīng)用設(shè)定循環(huán)數(shù)。如果循環(huán)次數(shù)太少，擴增量不足；如果循環(huán)次數(shù)太多，錯配機率會增加，非特異性背景嚴重。所以在保證產(chǎn)物得率的前提下應(yīng)盡量減少循環(huán)次數(shù)。

儲存條件：-20℃，避免反復(fù)凍融。

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貨號	名稱	規(guī)格
BTN60804	PCR抑制物清除劑	1mL
BTN70902	5M甜菜堿溶液，PCR級	1.5mL
BTN130923	LAMP擴增陽性對照	50次
YT376	PCR Buffer套裝(用于PCR優(yōu)化)	5ml
ALH286	10mM dNTP混合溶液	1ml|5ml
ALH257	M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(不含RNase H活性)	10KU|10KU×5

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