細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(中性紅法)是利用細胞對中性紅的攝入能力來檢測細胞增殖或細胞毒性。中性紅可以被活細胞所攝入，并在溶酶體中積累。在細胞增殖加快時，細胞數量增多，可以攝入的中性紅的量就會增加。在細胞受到損傷時，中性紅的攝入能力會下降。這樣通過對于中性紅攝入量的不同就可以確定細胞的增殖或毒性情況...

樣本類型：

● 懸浮細胞 ● 貼壁細胞

試劑盒以外自備試劑和儀器：

● CO₂培養箱 ● 帶540nm濾光片的酶標儀/分光光度計 ● PBS或HBSS（無酚紅） ● 96孔培養板

使用注意事項：

● 中性紅染色液長期存放會產生沉淀。出現結晶可以37℃水浴后搖勻溶解，染液是過量的，可以直接吸取染色液的上清液使用，也可以使用針頭濾器等過濾去除沉淀后繼續使用，不會影響使用效果。

● 96孔板在細胞培養過程中會存在蒸發問題。在加入中性紅染色液前，如果培養液存在明顯的蒸發問題，會影響細胞的生長狀態，并嚴重影響后續的檢測結果。

● 部分藥物可能對檢測有影響，有影響時需換液后檢測，無影響時直接檢測。用培養基或PBS 來配制待檢測藥物，加入中性紅試劑，測藥物溶液在540 處的吸光度。如果該吸光度與不含藥物僅加中性紅試劑的培養基或PBS 吸光度差異不大，則可以直接加入中性紅，如果吸光度相對較大，則需要除去培養基，并用新鮮培養基洗滌細胞兩次，然后加入新的200μL培養基和20μL中性紅進行檢測。

● 如果樣品為高渾濁度的細胞懸液，或者為了去除其它顏色物質的影響，建議設定690nm作為參比波長，以OD540扣除參比波長的OD值即可。

● 加中性紅后孵育時間的長短根據細胞的類型和細胞的密度等實驗情況而定，對于大多數情況孵育2小時即可，有些細胞需要培養較長時間。

● 檢測貼壁細胞時，中間的換液、洗滌等步驟如有漂浮細胞，需收集漂浮細胞和貼壁細胞后合并染色。部分細胞失去貼壁能力而漂浮于培養基，此部分細胞對結果有顯著影響，不可隨意丟棄，需離心后收集與貼壁細胞一起檢測，才能全面的反映出細胞的整體情況。

● 96孔板液體應使用移液器吸出，不可傾倒。一次處理過多的孔，加液時操作時間過長，可導致細胞干燥失水而死。懸浮細胞以及一些貼壁不牢的細胞會因傾倒而丟失。

● 以下以96孔板每孔200μL為例，如果不是使用96孔板檢測，中性紅溶液的用量相應等比例增加即可。

使用方法：

1、收集細胞，加細胞懸液200μL（約10000個細胞）到96孔板（邊緣孔用無菌水或PBS填充）。每板設對照（加200μL培養基）。

2、置37℃，5% CO₂孵育過夜，倒置顯微鏡下觀察。

3、每孔加入10μL待檢測藥物溶液，37℃孵育。

【注】：

● 此處以藥物處理細胞為例，實際以自己的細胞樣品為準。

● 用各種其他方法制備的細胞模型按下面方法加入中性紅試劑后檢測即可。

● 設置好適當的陰性對照和陽性對照。

4、至待檢測時間點，每孔加入20μL中性紅溶液，37℃孵育1-4小時。

【注】：

● 此處以96孔板加樣為例，實際檢測時以自己的細胞培養容器為準。

● 按培養基的用量的10%比例添加中性紅試劑即可。

● 如果培養基中的藥物不會對后續檢測產生干擾，直接加入20μL中性紅染色液；如果培養基中的藥物可能會對后續檢測產生干擾，先用PBS、DPBS或HBSS等適當溶液洗滌1-2次，隨后加入200μL新鮮的細胞培養基，并加入20μL中性紅染色液。

● 一般2小時即可。對于細胞密度非常低，細胞代謝速率非常慢的情況，可以把孵育時間延長到3-4個小時。

● 染色后可以在顯微鏡下檢測細胞狀態，細胞內應看到暗紅色膜泡，如果顯微鏡有黃色濾光片，可看到更清晰的亮紅色膜泡。

5、移除含有中性紅染色液的細胞培養基，用PBS、DPBS或HBSSS等適當溶液洗滌1-2次。

【注】：

● 檢測貼壁細胞時，中間的換液、洗滌等步驟如有漂浮細胞，需收集漂浮細胞和貼壁細胞后合并染色。部分細胞失去貼壁能力而漂浮于培養基，此部分細胞對結果有顯著影響，不可隨意丟棄，需離心后收集與貼壁細胞一起檢測，才能全面的反映出細胞的整體情況。

6、加入200μL中性紅檢測裂解液，室溫搖床上裂解20分鐘。在搖床上搖動可以促進樣品的裂解。

7、測定540nm各孔的吸光值。

8、同時設置空白孔（培養基和中性紅溶液，無細胞），對照孔（不加藥培養基和中性紅溶液，有細胞），每組設定3-5復孔。

【注】：

● 復孔數量根據自己實際需要設定，為了降低試劑消耗成本，可以少設復孔。

結果分析：

細胞活力計算：

將各測試孔的OD值減去調零孔OD值或對照孔OD值。各重復孔的OD值取平均數。

細胞活力%=（加藥細胞OD-空白OD）/（對照細胞OD-空白OD）×100

常見問題分析：

● 檢測時需要換液嗎？

如果待測藥物有還原性，需要換液，否則不需要。
● 如何判斷待測藥物是否含有還原性？

測定不含細胞，僅含有待測藥物的溶液加入中性紅反應后的在540nm處的空白吸光度。如果該吸光度很小，說明待測藥物沒有還原性或還原性很小，對中性紅沒有影響，則可以不換液，在培養基中直接加入中性后；如果吸光度相對較大，說明藥物具有較強的還原性，則需要除去含藥物的培養基，并用新鮮培養基洗滌細胞兩次，然后加入新的200μL培養基和20μL中性紅進行檢測。