本試劑盒按每個樣本處理2mL血清/血漿計,每個50T試劑盒大約可以用于提取100mL血清/血漿。如果需要處理大量的血清/血漿,將提取液按說明書標準操作的體積等比例調整即可。...

產品特點：

● 使用方便,無需超速離心,省時省力；

● 純度高,富集量大,應用范圍廣；

● 獲取的Exosome結構和功能完整；

● 穩定性好,便于運輸,便于保存。

使用注意事項：

● 螺旋蓋微量試劑管裝試劑開蓋前請短暫離心,避免開蓋時試劑損失。

● 可以根據自己實驗需要加入其它蛋白酶抑制劑。

● 以下以2mL血清/血漿為例,實際操作時按血清樣本和提取液用量體積比等比例調整使用即可。

● 不同血清/血漿樣本外泌體數量差異極大,請根據實際情況選擇血清/血漿樣本量,根據下游應用和參考文獻確定。條件允許情況下采用盡可能多的樣本。

● 常規的血清/血漿樣本最佳培養上清上樣量為5-10mL及以上,條件允許的情況下采用盡可能多的血清/血漿樣本。

● 已經分離好的外泌體樣本如果需要進行電鏡觀察,只能冰上或4℃保存,存放時間不超過兩天,注意不可冷凍保存,否則可能會影響電鏡觀察效果。

操作步驟：

1、收集2mL待提取的血清/血漿樣品,置2-8℃保存。

【注】：

● 凍存樣品解凍后置2-8℃保存。

2、將樣品在4℃條件下,3000×g離心15分鐘。棄沉淀,收集上清。

3、小心將上清移入另一干凈離心管中。

4、將樣品在4℃條件下,10000×g離心20分鐘。棄沉淀,收集上清。

5、小心將上清移入另一干凈離心管中。

6、在2mL血清/血漿樣品中加入2mL提取液A,蓋緊離心管蓋,上下顛倒混勻1分鐘左右,使液體充分混勻。

7、在4mL液體樣品中加入1mL提取液B,蓋緊離心管蓋,上下顛倒混勻1分鐘左右,使液體充分混勻。

【注】：

● 試劑B使用前請充分混勻。

8、置2-8℃冰箱靜置過夜。

【注】：

● 靜置保存時間不少于10小時。

9、在4℃條件下,10000×g離心60分鐘。

10、小心移除上清,收集沉淀。

【注】：

● 盡可能吸干上清。

● 吸取時小心,防止吸掉沉淀。

11、取50-100μL外泌體保存液將沉淀重懸,即得到外泌體樣品。

【注】：

● 可以不用試劑盒中的外泌體保存液試劑C,根據下游實驗需要用自己的其它緩沖液重懸保存外泌體。

● 也可直接用于蛋白提取。

● 血漿和血清樣本的外泌體提取會得到較多的膠狀沉淀，可以延長移液器吹打混勻時間或者渦旋振蕩時間至完全溶解為止。

● 膠狀沉淀難溶解可以適當增加保存液的用量。

12、將外泌體樣本-80℃保存或直接用于下游應用。

【注】：

● 外泌體短期保存置于2-8℃保存即可,一周以上長期不用時置-80℃保存。

● 保存前可以用0.22μm過濾除菌。

常見問題分析：

● 采用血漿(plasma)還是血清(serum)來源的外泌體？

對于大多數涉及到Exosome RNA分離的研究,我們推薦使用血漿(plasma)。因為血清收集后在凝血過程中,血小板受到刺激會產生許多Exosome和其他形式的小泡,因此血清中獲得的小泡始終比血漿中多,甚至超過50%小泡來源于血小板。所以血漿是研究病理生理狀態下Exosome更好的介質。多數的criculating Exosome研究樣本使用的是血漿。負壓采血之后,血液首先存放入采血管,去除止血帶,最初的幾毫升不要,因為有壓力激活效應,并且被成纖維細胞污染。血液收集應該輕柔并且迅速。顛倒混勻采血管8-10次,與管壁上的抗凝劑混合,但不要為了抗凝而劇烈搖動。離心前管子應該垂直存放,并記錄實驗室中存放的時間,因為從采血到離心除去細胞和血小板這中間的過程很重要,建議在30min內完成,長時間存放,而沒有及時處理會導致血小板細胞Exosome的進一步釋放。血液要盡快處理,在室溫條件下分離血漿(或者血清)。所有樣品要使用相同的轉速和轉子類型離心。

● 怎樣選擇抗凝劑？

抗凝劑有一個或多個形式的功能,包括螯合鈣、蛋白酶抑制和抑制血小板活化。一般選用EDTA 抗凝。其它有許多抗凝血劑可用,但不建議使用肝素抗凝劑。無論是外源性或內源性起源(例如肥大細胞),肝素會抑制下游PCR反應,因為肝素會與引物和酶競爭與核酸結合。另外,肝素可抑制Exosome與靶細胞的結合,抑制Exosome激活血小板或降低血小板激活閾值。應用肝素治療的病人也應該注意。對于珍貴樣本,可能需要從肝素化的血液樣品中提取RNA。核酸的檢測需要通過調整PCR的敏感性。另外如果Exosome相關核酸被發現只存在于Exosome內,在RNA分離之前的洗滌也可以幫助去除肝素。其它抗凝劑如EDTA、氟化鈉/草酸鉀, 或檸檬酸三鈉[加入/不加右旋糖或茶堿、腺苷和雙嘧達莫]就更復雜了,最好根據下游的試驗來指導。CTAD阻礙血小板活化和隨后的Exosome釋放。EDTA可干擾PCR反應(盡管程度低于肝素),但它的存在可能是無害的。另外,下游實驗的選擇需要考慮到抗凝劑的使用種類。不同的聚合酶對抑制劑有不同的敏感性。

● 采血管的選擇方法？

血漿采用紫蓋采血管(EDTA-K2或EDTA-K3),例如BD貨號：367841-2mL

367862-4mL 367863-6mL 366643-10mL等；血清采用黃蓋采血管(促凝管或促凝

管帶分離膠),例如BD貨號：366566-5mL 367985-10mL等。

● 如何鑒定提取的外泌體？

通常使用透射電鏡檢測(形態)、粒徑檢測(大小)、外泌體標志蛋白Western blot

檢測等方法鑒定提取的外泌體。

● 外泌體WB標志蛋白用什么？

在進行WB檢測時,通常檢測外泌體標志蛋白為CD63、CD9、CD81、TSG101、ALIX、HSP70等。

● 進行外泌體WB鑒定時有什么內參蛋白可供選擇？

沒有,該檢測屬于定性檢測。

● 蛋白濃度低？

很多細胞外泌體量不夠下游應用,在條件允許的情況請盡可能加大培養上清的上樣量。處理部分樣本時可能沒有裂解完全,導致蛋白濃度低。請選擇高質量的蛋白裂解液或蛋白提取試劑盒。

● 抽提得到的RNA濃度低？

很多細胞外泌體量不夠下游應用,條件允許情況請盡可能加大培養上清上樣量。