本產品是一種高效的高產膜蛋白提取試劑盒。提供全套試劑，適用于從細胞和動物組織提取膜蛋白和胞漿蛋白。提取國產簡單方便。本試劑盒提取的蛋白可用于WB、蛋白質電泳、免疫沉淀、ELISA、轉錄活性分析、Gel shift凝膠阻滯實驗、酶活性測定等下游蛋白研究實驗。本試劑盒提取的蛋白為具有天然蛋白構象的活性蛋白。本試劑盒不含...

使用方法：

提取液準備

每500μL冷的蛋白提取液A中加入2μL蛋白酶抑制劑混合物，2μL蛋白穩定劑，混勻后置冰上備用。

每500μL膜蛋白溶解液C中加入2μL蛋白酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用。

【注】：

● 根據需要處理的樣品數量準備蛋白提取液，蛋白酶抑制劑混合物不可以一次全部加入提取液。

● 加過蛋白酶抑制劑的提取液一周內未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制劑。

● 提取液A在使用前需一直置于2-8℃條件，否則下游膜蛋白提取時會導致不容易分層。

● 以下步驟中使用的蛋白提取液為此步配制好的含蛋白酶抑制劑的提取液。

細胞蛋白提取

1、取5-10×10⁶個以上細胞，在4℃，500×g條件下離心2-3 分鐘，小心吸取培養基，盡可能吸干，收集細胞。

【注】：

● 細胞數量根據實驗調整，由于膜蛋白含量較少，需要較多細胞才能保證得率。

2、用冷PBS洗滌細胞兩次，每次洗滌后盡可能吸干上清。

3、細胞樣品中加入200μL冷的試劑A，高速渦旋振蕩5 秒，置2-8℃振蕩30分鐘-1小時。

【注】：

● 此步驟必須在2-8℃條件振蕩。

● 振蕩時用振蕩器/搖床的較低轉速，保持液體稍微晃動即可。

● 無2-8℃振蕩條件也可不振蕩，置2-8℃靜置，稍微延長提取液處理時間，中間每隔幾分鐘用移液器吹打混勻。

● 提取液A處理后細胞沉淀應明顯減少，否則延長處理時間。

● 此步如果細胞裂解不充分，下步有大量細胞沉淀，請延長2-8℃振蕩裂解時間至40分鐘或更長，直至細胞充分裂解。

4、再次高速渦旋振蕩5秒，然后在4℃，13000×g條件下離心5分鐘。

5、將上清吸入另一預冷的干凈離心管，37℃水浴10分鐘，37℃條件下2000×g離心3分鐘，此時溶液分為兩層（對著光線看），下層約為20-50μL。

【注】：

● 必須37℃水浴和離心。

● 沒有37℃離心條件可以不離心，延長水浴時間至分層明顯即可。

6、小心收集上層，即為胞漿蛋白，下層為膜蛋白。

【注】：

● 此時得到的膜蛋白樣品即可用于下游實驗。在下層膜蛋白中加入50-200μL冰冷的試劑C溶解膜蛋白，充分混勻，即可用于下游應用。

● 膜蛋白比較難溶解，不能很快溶解混勻，可以在加入溶解液后稍微吹打混勻，然后置于4℃冰箱靜置。中途用移液器輕輕吹打混勻一次。靜置后取出再次用移液器稍微吹打混勻即可。

● 置4℃靜置至管底透明膠狀物完全溶解。

● 下面的第7-8步驟可以不做，如果需要進一步提高膜蛋白純度，可以選做，但是會降低膜蛋白的回收率，損失一部分膜蛋白。

7、用150-200μL冰冷的試劑B稀釋下層膜蛋白部分，混勻后冰浴2分鐘，然后37℃水浴5-10分鐘，37℃條件500-2000×g離心3分鐘，此時溶液分為兩層，下層約為20-50μL。

8、小心移除上層，用50-200μL冰冷的試劑C溶解下層，即得膜蛋白。

【注】：

● 膜蛋白比較難溶解，不能很快溶解混勻，可以在加入溶解液后稍微吹打混勻，然后置于4℃冰箱靜置。中途用移液器輕輕吹打混勻一次。靜置后取出再次用移液器稍微吹打混勻即可。

● 置4℃靜置至管底透明膠狀物完全溶解。

9、將上述蛋白提取物定量后分裝于-80℃冰箱保存備用或直接用于下游實驗。

【注】：

● 建議用BCA法進行蛋白定量。

● 蛋白樣品-80℃存放一年沒問題。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被細菌污染。

組織蛋白提取

1、取適量組織樣本用手術剪刀盡可能剪碎，加入冷的蛋白提取液A，用組織勻漿器勻漿至無明顯肉眼可見固體，將勻漿吸入另一預冷的干凈離心管。

2、按照細胞蛋白的提取方法的第2步驟往下操作即可。

常見問題分析：

● 蛋白濃度低？

膜蛋白豐度較低，需要保證足夠的細胞量，在條件允許的情況下，盡可能增加細胞量。處理部分組織樣本時可能沒有裂解完全,導致蛋白濃度低。只要適當延長試劑A的處理時間即可。最好在持續振蕩的條件下處理,沒有振蕩器也可間隔幾分鐘用吸頭吹打混勻。

● 用什么方法定量蛋白？

建議用BCA法。不適合用Bradford 法,因為試劑A 中含有干擾Bradford 法的組份,導致定量不準。如果已經進行過透析處理或者用脫鹽柱改換過緩沖體系,則可以用Bradford 法定量。

● 提取的蛋白具有活性嗎？

本試劑盒不含有離子型去垢劑組份,不破壞蛋白的結構,沒有對蛋白質之間原有的相互作用的破壞,蛋白均保持其天然構象和活性。

● 膜蛋白電泳沒有條帶？

膜蛋白樣品通常濃度較低，電泳前一定要進行蛋白定量，以保證電泳是蛋白上樣量足夠。

膜蛋白提取好后，用溶解液充分溶解后，可超聲處理一下，再進行蛋白定量。

蛋白加Loading Buffer后可以不用煮沸，采用50℃保溫30分鐘。

蛋白Loading Buffer中SDS終濃度含量可以提高至3%-10%。

有些樣品的膜蛋白含量太低，可以使用丙酮沉淀膜蛋白，再使膜蛋白溶解于上樣緩沖液中，一般可以跑出清晰的蛋白條帶。

電泳時最好采用低電壓低電流電泳。

膜蛋白豐度通常較低，有條件可以嘗試用銀染染色。