實驗方法原理 實時熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，zui后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。
實驗材料
細(xì)胞樣品
試劑、試劑盒
RNA提取試劑盒 熒光定量PCR Mix TRIZOL dNTP 氯-仿 逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV 異丙醇 Taq酶 DEPC水 ddH2O TE MgCl2 瓊脂糖 溴化乙錠 MOPS 甲醛 乙酸鈉 EDTA EB 溴酚蘭
儀器、耗材
離心管 離心機(jī) 風(fēng)光光度計 電泳槽 凝膠板 Realtime PCR儀

實驗步驟
一、 樣品RNA的抽提
1.  取凍存已裂解的細(xì)胞，室溫放置5分鐘使其完全溶解。
2.  兩相分離 每1 ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2 ml的氯-仿，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12 000 rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯-仿相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。
3.  RNA沉淀 將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12 000 rpm 離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。
4.  RNA清洗 移去上清液，每1 mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1 ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混勻后，4℃下7 000 rpm離心5分鐘。
5.  RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。

6.  溶解RNA沉淀 溶解RNA時，先加入無RNA酶的水4 0ul用槍反復(fù)吹打幾次，使其完全溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。


二、 RNA質(zhì)量檢測
1.  紫外吸收法測定
先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋（1:100）后，讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，測定RNA溶液 濃度和純度。
 （1）濃度測定
A260下讀值為1表示40 ug RNA/ml。樣品RNA濃度(μg/ml)計算公式為：A260 x 稀釋倍數(shù) x 40 ug/ml。具體計算如下：
RNA溶于40 ul DEPC水中，取5 ul，1:100稀釋至495 ul的TE中，測得A260 = 0.21
RNA 濃度= 0.21 x 100 x 40 ug/ml = 840 ug/ml 或 0.84 ug/ul
取5 ul用來測量以后，剩余樣品RNA為35 ul，剩余RNA總量為：
35 ul x 0.84 ug/ul = 29.4 ug
（2）純度檢測

RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度，比值范圍1.8到2.1。


2.  變性瓊脂糖凝膠電泳測定
（1）制膠
1 g瓊脂糖溶于72 ml水中，冷卻至60℃，10 ml的10 x MOPS電泳緩沖液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。
10x MOPS電泳緩沖液
濃度  成分
0.4 M  MOPS，pH 7.0
0.1 M  乙酸鈉
0.01 M  EDTA
灌制凝膠板，預(yù)留加樣孔至少可以加入25 μl溶液。膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內(nèi)，加足量的1xMOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個毫米。
（2）準(zhǔn)備RNA樣品
取3 ugRNA，加3倍體積的甲醛上樣染液，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10 ug/ml。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。
（3）電泳
上樣前凝膠須預(yù)電泳5 min，隨后將樣品加入上樣孔。5-6 V/cm電壓下2 h，電泳至溴酚蘭指示劑進(jìn)膠至少2-3 cm。
（4）紫外透射光下觀察并拍照

28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃（其大小決定于用于抽提RNA的物種類型），上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀察到一個geng小稍微擴(kuò)散的帶，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖體RNA）組成。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質(zhì)，可能是由mRNA和其它異型RNA組成。RNA制備過程中如果出現(xiàn)DNA污染，將會在28S核糖體RNA帶的上面出現(xiàn)，即geng高分子量的彌散遷移物質(zhì)或者帶，RNA的降解表現(xiàn)為核糖體RNA帶的彌散。用數(shù)碼照相機(jī)拍下電泳結(jié)果。


三、樣品cDNA合成
1.  反應(yīng)體系
序號          反應(yīng)物           劑量
1          逆轉(zhuǎn)錄buffer       2 ul
2         上游引物              0.2 ul
3         下游引物              0.2 ul
4          dNTP                   0.1 ul
5       逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV     0.5 ul
6         DEPC水              5 ul
7          RNA模版            2 ul
8           總體積               10 ul
輕彈管底將溶液混合，6 000 rpm短暫離心。
2.  混合液在加入逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV 之前先70℃干浴3分鐘，取出后立即冰水浴至管內(nèi)外溫度一致，然后加逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 ul，37℃水浴60分鐘。

3.  取出后立即95℃干浴3分鐘，得到逆轉(zhuǎn)錄終溶液即為cDNA溶液，保存于-80℃待用。



四、 梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品及待測樣品的管家基因（β-actin）實時定量PCR
1.  β-actin陽性模板的標(biāo)準(zhǔn)梯度制備 陽性模板的濃度為1011，反應(yīng)前取3 μl按10倍稀釋（加水27 ul并充分混勻）為1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104，以備用。
2.  反應(yīng)體系如下：
標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)體系
序號           反應(yīng)物                           劑量
1       SYBR Green 1 染料             10 ul
2       陽性模板上游引物F              0.5 ul
3      陽性模板下游引物R              0.5 ul
4                 dNTP                            0.5 ul
5                 Taq酶                           1 ul
6           陽性模板DNA                    5 ul
7              ddH2O                            32.5 ul
8               總體積                            50 ul
輕彈管底將溶液混合，6 000 rpm短暫離心。
3.  管家基因反應(yīng)體系：
序號            反應(yīng)物                                劑量
1      SYBR Green 1 染料                   10 ul
2      內(nèi)參照上游引物F                         0.5 ul
3     內(nèi)參照下游引物R                         0.5 ul
4               dNTP                                    0.5 ul
5               Taq酶                                   1 ul
6      待測樣品cDNA                             5 ul
7              ddH2O                                  32.5 ul
8             總體積                                    50 ul
輕彈管底將溶液混合， 6000 rpm短暫離心。

3.  制備好的陽性標(biāo)準(zhǔn)品和檢測樣本同時上機(jī)，反應(yīng)條件為：93℃?2分鐘，然后93℃ 1分鐘，55℃ 2分鐘，共40個循環(huán)。


五、 制備用于繪制梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線的DNA模板
1.  針對每一需要測量的基因，選擇一確定表達(dá)該基因的cDNA模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。
2.  反應(yīng)體系
序號                     反應(yīng)物                        劑量
1                     10× PCR緩沖液            2.5 ul
2                           MgCl2 溶液              1.5 ul
3                           上游引物F                 0.5 ul
4                           下游引物R                0.5 ul
5                            dNTP混合液            3 ul
6                            Taq聚合酶               1 ul
7                             cDNA                       1 ul
8                    加水至總體積為               25 ul
輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
35個PCR循環(huán)（94℃1分鐘；55℃1分鐘；72℃1分鐘）； 72?C延伸5分鐘。
（3）PCR產(chǎn)物與 DNA Ladder在2％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴(kuò)增條帶。

（4）將PCR產(chǎn)物進(jìn)行10倍梯度稀釋: 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行10倍梯度稀釋: 設(shè)定PCR產(chǎn)物濃度為1×1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104幾個濃度梯度。


六、 待測樣品的待測基因?qū)崟r定量PCR
1.  所有cDNA樣品分別配置實時定量 PCR反應(yīng)體系。
2.  體系配置如下：
序號             反應(yīng)物                                劑量
1            SYBR Green 1 染料               10 ul
2                上游引物                               1 ul
3                下游引物                               1 ul
4                  dNTP                                   1 ul
5              Taq聚合酶                               2 ul
6             待測樣品cDNA                        5 ul
7                   ddH2O                              30 ul
8                   總體積                               50 ul
輕彈管底將溶液混合，6 000 rpm短暫離心。

（3）將配制好的PCR反應(yīng)溶液置于Realtime PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件為：93℃ 2分鐘預(yù)變性，然后按93℃ 1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘，共40做個循環(huán)，zui后72℃7分鐘延伸。


七、 實時定量PCR使用引物列表
引物設(shè)計軟件：Primer Premier 5.0，并遵循以下原則：引物與模板的序列緊密互補(bǔ)；引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)；引物不在模板的非目的位點引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)(即錯配)。
八、電泳

各樣品的目的基因和管家基因分別進(jìn)行Realtime PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物與 DNA Ladder在2％瓊脂糖凝膠電泳，GoldView染色，檢測PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴(kuò)增條帶。


注意事項
1.熒光閾值：在熒光擴(kuò)增曲線指數(shù)增長長期設(shè)定一個熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)（即PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量標(biāo)準(zhǔn)）。熒光閾值可設(shè)定在指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，但實際應(yīng)用要結(jié)合擴(kuò)增效率，線性回歸系數(shù)等參數(shù)來綜合考慮。
2.Ct值：在PCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物（熒光信號）到達(dá)閾值時所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)。Ct值具有-好的重復(fù)性。
其他
實時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個基礎(chǔ)之上的：
1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性-好，即同一模板不同時間擴(kuò)增或同一時間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。
外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量zui準(zhǔn)確，重現(xiàn)性zui好的定量方法，已得到全的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域