一、免疫熒光技術中標本制作的基本程序近似于酶免疫組化，不同點如下：

1、免疫熒光不需要使用雙氧水處理，封閉和一抗孵育與其相同。

2、免疫熒光的二抗使用不同熒光標記的二抗孵育，孵育時間根據抗體的工作濃度確定。

3、二抗孵育之后充分洗片后即可貼片、封片和觀察。

4、免疫熒光在封片時常使用封片劑或甘油：0.01M PBS （1：1）。條件許可，建議購買抗淬滅的封片液，使標本可以保存久。

5、熒光抗體的孵育以及后續處理需要避光。

6、熒光抗體染色假陽性可能會多，需要分別設定陽性和陰性對照。

二、注意事項

1、熒光染色后一般在1h內完成觀察，或于4℃保存4h，時間過長，可能會使熒光提前衰退。

2、每次試驗均需設置以下三種對照：

（1） 陽性對照：陽性血清+熒光標記物；

（2） 陰性對照：陰性血清+熒光標記物；

（3） 熒光標記物對照：PBS+熒光標記物。

三、免疫熒光雙標的經驗之談

1、選取一抗時，要求來源于兩種不同的動物，來源于家兔和大鼠的抗體，二抗則是不同熒光信號標記的，donkey anti-rabbit-FITC（綠）和donkey anti-rat-Tex-Red（紅）。

2、兩種一抗同時孵育，然后兩種二抗同時孵育。抗體濃度、孵育時間要自我摸索，一抗4℃孵育過夜比較好，背景比較清晰。

3、陽性對照采用的是陽性組織切片，陰性對照則分別是家兔和大鼠的IgG，熒光標記物對照是PBS+熒光標記物。

4、封閉血清是二抗來源動物的正常血清，用的是10%正常donkey血清。

5、其余事項同免疫熒光單標操作。