古朵簡述：皮質醇ELISA試劑盒常見的定量方法

  測定原理：現在皮質醇ELISA試劑盒除非是測定抗體的以外，一般使用的是雙抗體夾心法，此種方法大多數用的是增強的雙抗體夾心法，即使用生物素-親和素系統，還有少數的指標可能使用競爭法，這類方法適用于半抗原的測定。

  具有復雜結構的多表位蛋白抗原，其雙抗體夾心法中的一個抗體必須用單抗，否則背景很高。當然如果兩個都是單抗(這兩個單抗針對不同表位)，那么測定的線性范圍就較寬，試劑盒性能就較好;一個用單抗，一個用多抗，測定的靈敏度會較高。

  某些簡單的化合物用皮質醇ELISA試劑盒測定時，因為沒有兩個或以上的表位，一般只能作為半抗原，只能用競爭法測定。如果你發現有測定簡單化合物(如雌激素、NO、等)用雙抗體夾心法作測定原理時，這個試劑盒你就要懷疑了。另外還要說明一步雙抗體夾心法與兩步雙抗體夾心法的區別。

  一步雙抗體夾心法的吸光度-劑量曲線呈鐘形，隨著待則標本中抗原濃度的增加而升高至一定程度后，測定吸光度即隨抗原濃度的增加而開始下降直至不顯色，即所謂的“鉤狀效應”(hookeHect)，也就是我們在免疫沉淀試驗中所稱的“帶現象”(zonephenomenon)。所以當使用一步雙抗體夾心法時，樣品濃度太高，有時會出現測不出來的現象，此時要作適當的稀釋才能準確測定。

  皮質醇ELISA試劑盒的組成：用雙抗體夾心法作為測定的方法時，試劑盒的組成一般包括：已包被單抗的酶標板：一塊，有96孔的，也有48孔的，可拆缷，外面有鋁箔袋密封，打開后有干燥劑，實驗時暫未使用的酶標條要連帶干燥劑密封好，放在4℃冰箱中妥善保存。

  皮質醇ELISA試劑盒操作步驟

  1、準備：從冰箱取出試劑盒，室溫復溫平衡30分鐘。

  2、配液：用蒸餾水將20倍濃縮洗滌液稀釋成原倍的洗滌液。

  3、加標準品和待測樣本：取足夠數量的酶標包被板，固定于框架上，分別設置標準品孔、待測樣本孔和空白對照孔，記錄各孔位置，在標準品孔中加入標準品50μL;待測樣本孔中先加入待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL(即樣本稀釋5倍);空白對照孔不加。

  4、溫育：37℃水浴鍋或恒溫箱溫育30min。

  5、洗板：棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板4次(也可用洗板機按說明書操作洗板)。

  6、加酶標工作液：每孔加入酶標工作液50μL，空白對照孔不加。

  7、溫育：重復4的操作。

  8、洗板：重復5的操作。

  9、顯色：每孔先加入顯色劑A 液50μL，再加入顯色劑B液 50μL，37℃避光顯色15min。

  10、終止：取出酶標板，每孔加終止液50μL，終止反應(顏色由藍色立轉黃色)。

  11、測定：以空白孔調零，在終止后15分鐘內，用450nm波長測量各孔的吸光值(OD值)。

  12、計算：根據標準品的濃度及對應的OD值，計算出標準曲線的直線回歸方程，再根據樣本的OD值，在回歸方程上計算出對應的樣品濃度，也可以使用各種應用軟件來計算。終濃度為實際測定濃度乘以稀釋倍數。

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