細胞凍存、復蘇及細胞均勻鋪板技巧詳解

  細胞凍存：

  1. 實驗前準備：細胞室及工作臺紫外線照射15min;培養液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、恒溫水浴箱37℃預熱備用;收集對數生長期細胞，在凍存前一天換液

  2.用吸管吸出培養瓶中的細胞培養液，PBS清洗2遍吸出沖洗液，加入適量胰蛋白酶消化。

  3. 適時去掉胰蛋白酶，加入少量新培養液。吸管吸取培養液吹打瓶壁上的細胞，使其成為均勻分散的細胞懸液。

  4. 用吸管將培養液加入凍存管中，離心(1000r/min，10分鐘)。

  5. 去上清液，加入與細胞懸液等量的凍存液，用吸管輕輕吹打使細胞均勻

  6. 冷存管置于4℃10分鐘----20℃30分鐘----80℃16～18小時(或隔夜)---液氮槽vaporphase長期儲存。-20℃不可超過1h，以防止胞內冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

  7.記錄每一個冷凍管的位置以確保在以后應用時能夠找到每一個冷凍管。

  細胞復蘇

  室內紫外消毒;培養基、PBS于37℃恒溫水浴預熱備用。

  自液氮罐中取出冷凍管，立即放入37℃水槽中快速解凍，離心。

  去上清，加入培養基，吹打，然后移入培養瓶中，用培養基清洗凍存管，清洗液也移入培養瓶中。

  于培養瓶中加入適量培養基，放入CO2培養箱中培養

  記錄復蘇日期;次日換液。

  細胞均勻鋪板技巧：

  1、一般96孔板,每孔是加100微升細胞懸液，從孔的左邊靠近底部加入，加完半邊板后，將未加的細胞懸液混一下再，繼續加剩余的半邊板子，都加完后蓋上蓋子，左手輕輕扶住板的左邊，右手輕輕敲擊板的右邊緣，注意把握力度，太強或次數太多會導致細胞集中成堆，將板順時針旋轉(逆時針效果不好)，依次敲擊剩余三個邊，靜置約5分鐘，放入37度培養箱。

  6孔板12孔板或24孔板，均采用將個孔加入少量無血清培養基，晃動浸潤整個孔底，然后用移液槍吸至第二孔，同樣方法浸潤孔底，其它孔一次類推，這樣整個孔底都是濕潤的，細胞懸液會平鋪在整個孔底，加細胞懸液的時候可以避免加在中間中間細胞多，而加在周邊晃勻后周邊細胞多中間少的現象，細胞分散較均勻，注意加完細胞懸液后要放工作臺靜置一下。

  2、細胞懸液加完后，將細胞培養板抬高，對著燈光，從底部往上看，看細胞有沒有抱團。然后從底部敲擊，使之分散。

  3、如果實驗室有平板振蕩器的話，建議用這個儀器稍振蕩一下，效果不錯，就是振幅小，頻率高的那種。

  4、細胞要盡量打散，大部分呈單個狀態。離心后，要充分懸浮!還有轉移到六孔板后，是要晃得!晃的時候不要讓那個細胞液轉圈，不然細胞就全被帶到中間去了，就會不均勻!

  5、一瓶細胞長滿后，正常處理，在培養瓶里吹勻，然后鋪6孔板，每孔2毫升，鋪完之后不用觀察直接用酒精棉擦拭，然后放到培養箱里，輕微的左三圈 右三圈 前三圈 后三圈。基本上24小時之后觀察 每孔的細胞都會很均勻。

  6、計算好所需要的全部液體量和細胞量，混勻后，加到六孔板里，六孔板按橫8字型晃，顯微鏡下觀察，如果不均勻，按上述方法再晃。如果細胞未計數直接種的話，在種六孔板的過程中，隨時晃一下混勻用的瓶子，瓶子我通常是順時針或逆時針轉圈。

  7、放在水平板面上先上下移動，再左右移動，每個方向5到6次，但關鍵的是搖完后直接放入培養箱中，不要再做過多的運動，例如放到鏡下去看，否則很容易就又聚到中間去了。

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