培養用液選擇、配制和無菌分裝

  一、培養用液及無菌試劑的選擇

  哺乳動物細胞體外培養是否正常，關鍵的影響因素有培養用液配制用水純度、無菌操作嚴格程度、培養液選擇、試劑選擇等方面，其中任意一種因素都可能是致命性的影響，導致不可挽回的后果。下面將簡要介紹培養用液及其他無菌試劑的選擇原則和注意事項。

  (一)液體培養基和干粉基礎培養基

  1.品牌選擇

  適用于哺乳動物細胞培養的液體培養基和干粉基礎培養基均需從商品供用戶選擇，著名的品牌如Gibco、Sigma、ATCC等。

  從Gibco的網頁可查詢到，他們專門為哺乳動物細胞培養、原代細胞培養、干細胞培養、昆蟲細胞培養等方面提供了各種套餐式培養基產品服務，關于哺乳動物細胞培養用液的種類非常齊全。另外，為轉染也提供配套使用的試劑。

  轉染，也稱細胞轉化，都是指將外源基因轉入感受態靶細胞的方法，轉染方法包括共轉染、瞬時轉染、體內轉染、穩定轉染、電穿孔法轉染、磷酸鈣轉染和脂質體轉染等。

  2.培養基型號

  除了選擇品牌供應商外，還需特別注意所培養細胞適合的是何種培養液或干粉培養基。如常用的DMEM、RPMI1640、199、MEM等型號。

  3.包裝規格

  另外，就是選擇好培養液或干粉培養基的包裝規格，如Gibco的RPMI1640培養基的規格由4種搭配狀態：①谷氨酞胺添加狀態分為已添加GlutaMAX、已添加L-谷氨酞胺、未添加谷氨酞胺3種情形;②酚紅添加狀態分為是否添加2種情形;③培養基的物理形態包括固體和液體2種;④提供包括100m1/瓶、500ml/瓶、1L/瓶、5L/瓶和10L/瓶5種包裝規格備選。

  (二)哺乳動物細胞培養試劑

  哺乳動物細胞培養所需的其他試劑也要從品牌、試劑級別、包裝規格等要素進行采購，否則，影響培養細胞的正常生長和活性。

  1.緩沖液配制用化學試荊或成品緩沖液藥片

  一般要求AR(分析純)級以上純度的試劑，無機試劑從國內品牌供應商即可采購到，個別無機試劑和重要有機試劑如DMSO(二甲基亞砜)、BR(生物試劑)建議購買品牌供應商的產品，如Sigma品牌的產品。這些試劑都是非無菌包裝的，實際使用時需要注意。但是，一般在凍存細胞時，直接取DMSO配制新鮮凍存液而不會污染微生物，因為DMSO本身是不含活的微生物的，DMSO也稱萬-能溶劑，微生物是不能存活的。利用購買的試劑，按照緩沖液配方配制和濾過除菌或高壓蒸汽滅菌都是非常容易控制和操作的。

  成品緩沖液藥片是日常配制常用緩沖液如PBSA,Hank's溶液的便利選擇，容易保存。由于使用量偏大，容易配制，不建議直接購買無菌液體包裝的緩沖液。值得注意的是，成品緩沖液藥片不一定是無菌的，使用時需要注意藥品包裝說明。

  2.細胞培養添加物

  細胞培養添加物包括胎牛血清、生長因子、培養液補充物、培養用抗生素等，這些添加物都是無菌包裝的，存放和使用時注意嚴格無菌操作。有時也使用篩選后適合的小牛血清或新生牛血清替代胎牛血清，目前國內有多個品牌供應商提供胎牛血清。培養用抗生素可直接使用臨床使用的產品，如可以采用8×104U/2ml/支包裝的硫酸慶大霉素稀釋后直接添加到培養液中。

  細胞培養用的生長因子，以及培養液補充物如L-谷氨酞胺、葡萄糖等，建議從信譽好的制造商產品目錄中選擇，如Sigma產品。

  二、培養用液的配制

  細胞培養用液的配制用水z理想的是去除熱原、無核酸酶的超純水，也可使用新鮮制備的三蒸水、亞沸水或高純水機制備的高純水。一般而言，當配液用水的電阻率小于5MΩ·cm時，細胞活性容易受到干擾，如出現細胞形態變異、生長分裂受阻、壞死或凋亡等狀況。

  細胞培養用液配制過程使用的容器、攪拌子等器械，也務必使用配液用水潤洗2-3次方可使用。

  配制溶液過程中，由于開放的燒杯口、容量瓶口、三角燒瓶口均可受到環境粉塵的影響，因此，建議使用新鮮的保鮮膜遮蓋開口部分，尤其是為了充分溶解而進行長時間攪拌的過程中。建議配液全程注意，防止粉塵污染所配制的溶液。

  (一)干粉培養基選擇及其液體培養基的配制

  仔細閱讀干粉培養基的包裝說明，如lOX1L的包裝是指內含10小包，每小包配制1000m1培養液。

  配制時，適當添加血清以外的其他必需添加物，如抗生素、谷氨酰胺等，一并濾過分裝，保存于2-8℃冰箱。

  嚴格使用配制培養液的用水，建議使用超純水或其他新鮮制備的高純度的純水，如亞沸水、三蒸水、高純水機產的高純水等。

  使用于分裝的玻璃試劑瓶需要提前按要求進行清洗滅菌。滅菌包裝完整，保存在潔凈間內。

  (二)常用緩沖液的配制

  平衡鹽溶液即balancedsaltsolution，簡稱BSS。

  1.PBSA溶液

  KCl0.20g,KH2PO40.20g,MgSO4·7H2O0.98g,NaCl8.00g,Na2HPO4·7H2O2.16g,CaCl20.20g，加H2O至1000m1，過濾除菌或高壓滅菌，分裝后4℃保存。

  2.D-PBSA溶液KCl0.20g,KH2PO40.20g,NaCl8.00g,Na2HPO4·7H2O2.20g，加H2O至1000m1，過濾除菌或高壓滅菌，分裝后4℃保存。

  3.Hank's溶液

  Na2HPO4·H2O0.06g,KH2PO40.06g,MgSO4·7H2O0.20g,葡萄糖1.00g,NaCl8.00g,KCl0.40g,NaHCO30.35g，酚紅0.02g(其中，溶解NaHCO3后，將稱量好的酚紅一起溶解，均勻后再轉移到容量瓶)，CaC120.14g，加H2O至1000m1，過濾除菌或高壓滅菌，分裝后4℃保存。

  4.D-Hank's溶液

  Na2HPO4·H2O0.06g，KH2PO40.06g,NaCl8.00g,KCl0.40g,NaHCO30.35g，酚紅0.02g(其中，溶解NaHCO3后，將稱量好的酚紅一起溶解，均勻后再轉移到容量瓶)，加H2O至l000ml，過濾除菌或高壓滅菌，分裝后4℃保存。

  (三)消化液(胰蛋白酶消化液)的配制

  精-確稱取0.25g胰酶蛋白酶(活力為1，250)，加入l00ml不含Ca2+、Mg2+的D-Hank's或D-PBDA緩沖液溶解，濾器過濾除菌，4℃保存。

  胰蛋白酶溶液中也可加入終濃度為0.02%EDTA。

  (四)凍存液的配制

  9份10%BS培養液，1份DMSO。無菌條件下配制。DMSO無需濾過除菌，DMSO屬于萬-能溶劑，不存在微生物污染，是無菌的。但在放入超凈工作臺內前，需用酒精紗布擦拭外表面的粉塵。

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