甘油檢測試劑盒(組織，細胞)的原理

  描述：甘油是甘油三酯的水解產物。與游離脂肪酸一樣，甘油含量是甘油三酯水解反應的可靠檢測指標，但檢測加方便。本試劑盒采用優化步驟，能夠檢測實體組織、細胞中的甘油含量，線性范圍為10-1200μmol/L

  原理：在 ATP 存在下甘油被甘油激酶磷酸化為 3-磷酸甘油，再被甘油磷酸氧化酶氧化產生過氧化

  氫;在過氧化物酶作用下生色底物轉化為苯醌亞胺，其光密度值與甘油濃度成正比。

  適用范圍：測定實體組織、細胞中的甘油濃度。組成 (105 次微板測定或 30 次 1 ml 比色杯測定)：

  (1) 裂解液 50 ml

  (2) R1 試劑 16 ml

  (3) R2 試劑 4 ml

  (4) 4 mmol/L 甘油標準品 1 ml

  4 oC，儲存 3 月。

  所需設備：酶標儀、生化分析儀或 721、722 型可

  見光分光光度計。佳工作波長 550nm，如無此波

  長建議優先選用 570nm、次選 530、490nm。

  一 組織細胞裂解

  細胞(包括分化的脂肪細胞)裂解： 消化、離心收集細胞。或直接在培養皿內裂解。通常6孔板單孔約2x106個細胞，75cm2瓶約1x107細胞。按比例每 1~2 x 106細胞加 0.1ml 裂解液，混勻，靜置 10 分鐘。

  動物組織裂解：

  切記要預先將新鮮組織剪切稱重后再進行保存。組織凍存后再進行解凍、剪切、稱重可能會產生嚴重的測量誤差。離心管稱重，加入組織塊后再稱重，二者相減(即減量稱重法)計算組織量(約 100mg)。強烈建議按比例每 1mg 組織加10μl裂解液以減少樣品間蛋白和脂質含量變異而產生的誤差。(注意;裂解液用量在 1ml 或多可保證有效的裂解與脂質提取)。用電動高速勻漿器或手動玻璃勻漿器破碎組織。(不推薦超聲方法，因其不能*和均勻破碎。應根據預實驗調整初始的組織細胞加入量)，而后，靜置 10 分鐘。

  二. 裂解液處理：

  1. 取適量上清液轉移到 1.5ml 離心管中，進行步驟

  2 的操作。余下的裂解液可用 BCA 法蛋白定量試劑盒進行蛋白定量或-20oC 儲存。

  2. 70oC 加熱 10 分鐘滅活脂肪酶，可能出現絮狀沉淀。

  3. 室溫 5000rpm 離心 5 分鐘，上層清液即可用于酶學測定。

  三 工作溶液配制：按 4:1 比例，取 4 ml 試劑 R1 與1 ml 試劑 R2 混合即可，立即使用或 4oC 保存<1 天，變色棄去。(注意：謹防來源不明但容易發生的甘油污染，可來自操作者本人或標準品液體微粒濺射等。)

  四 標準品稀釋：用蒸餾水、生理鹽水或與樣品緩沖液*的液體，將 4 mM 甘油標準品倍比稀釋為1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125μmol/L，通常取其中 4~6 管即可，注意設置 0 濃度對照反應管。

  五 甘油測定

  1. 參見下表加樣。待測樣品體積 10μl，多加可能會抑制反應。

  2. 37oC 或 25oC 反應 10 分鐘。反應平衡后顏色在60 分鐘內穩定。

  3. 先用蒸餾水+工作液的空白管調零，然后測定各管 OD 值。

  4. 繪制標準曲線并計算甘油濃度。

  附 Excel 作圖步驟：各標準管 OD 值為 y 軸，標準品濃度為 x 軸。(1)鼠標左鍵圈住數據，點擊做圖向導，選擇-散點圖-，點擊-完成-。(2)鼠標右鍵點圖上的某一點，點擊-添加趨勢線-，點擊-選項-，點擊-顯示公式-和-R2 值-。

  5. 以每 mg 蛋白濃度或細胞數校正甘油含量。見說明書

  說明：

  1.血紅蛋白>2g/L、膽紅素>0.25g/L、二硫蘇糖醇、巰基乙醇、高濃度EDTA干擾測試。

  2.紅細胞糖酵解時合成磷酸甘油影響測定。

  參考文獻：

  1. Trinder, P. (1969). Ann. Clin. Biochem. 6: 24 – 27.

  2. Barham D and Trinder P. (1972). Analyst 97: 142 – 145

  甘油檢測試劑盒(組織，細胞)的原理

  甘油檢測試劑盒(組織，細胞) 上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區。是一家專門從事生物技術相關產品，勵志研發和銷售的綜合性生物公司，產品遠銷多個國家和地區，我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求"的經營宗旨;牢固樹立“以客戶需求為準則、以市場需求為導向，不斷開發高質量的新產品，提供客戶滿意的綜合服務質量"的方針。