過氧化物酶(POD)活性的測定的實驗步驟

  【實驗原理】

  植物體內的黃素氧化酶類代謝產物常包含H2 02 ，如光呼吸中的乙醇酸氧化酶、呼吸作用中 的葡萄糖氧化酶等。H2 02 的積累可導致破壞性的氧化作用。過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)是清除 H2 02 的重要保護酶，能將H2 02 分解為02 和H2 0, 從而使機體免受H2 02 的毒害作用。其活性與植物的抗逆性密切相關。

  (CAT)催化如下反應：

  2 H2 02 →2 H2 0 + 02

  本實驗通過測定H2 02 的減少量來測定CAT的活性。

  在H2 02 存在條件下，過氧化物酶能使愈創木酚氧化，生成茶褐色的4-鄰甲氧基苯酚。可用分光光度計測生成物的含量來測定活性。

  【試劑藥品

  1.50m mol/l pH7.0的磷酸緩沖液

  2.0.3% H2 02: 吸0.5ml 30% H2 02 加入pH7.0的磷酸緩沖液至 50ml

  3.0.2% 愈創木酚 :秤0.2g愈創木酚加入pH7.0的磷酸緩沖液至 100ml

  【實驗步驟】

  酶液的制備

  1.稱取葉片 0.25g ，加入5倍量的(M/V)pH7.0 的PBS 冰浴研磨 15000r/min

  離心15min取部分上清液經適當稀釋后用于酶活性測定。

  2. CAT 活性的測定

  在3ml的反應體系中，包括0.3% H2 02 1ml, H2 0 1.95ml, 后加入0.05ml酶液

  啟動反應，測定波長240nm處的OD降低速度。將每分鐘OD減少0.01定義為1個活力單位。

  3. POD 活性的測定

  在3ml的反應體系中，包括0.3% H2 02 1ml, .0.2% 愈創木酚0.95ml,pH7.0的PBS 1ml，后加入0.05ml酶液啟動反應，記錄470nm處OD增加速度。將每分鐘OD增加0.01定義為1個活力單位。

  4. 用考馬斯亮藍 G-250法測定蛋白含量.

  【實驗結果及計算】

  CAT和POD的酶活性以U/mg蛋白或U/gFW表示。

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