知識點分享：細胞凍存和復蘇的小細節

  細胞凍存及復蘇的基本原則是慢凍快融，實驗證明這樣可以大限度的保存細胞活力。目前細胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護劑，這兩種物質能提高細胞膜對水的通透性，加上緩慢冷凍可使細胞內的水分滲出細胞外，減少細胞內冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細胞損傷。復蘇細胞應采用快速融化的方法，這樣可以保證細胞外結晶在很短的時間內即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內形成胞內再結晶對細胞造成損傷。

  細胞復蘇是一個簡單的試驗操作，但操作中也有許多需要注意的事項，在實驗操作中注意細小的問題，才能使復蘇后的細胞保持良好的狀態，針對細胞復蘇應該注意以下幾點：

  1. 可以提前把需要的體積的培養液放到培養瓶里，擰松瓶蓋，放到孵箱里30分鐘--1個小時;

  2. 為防止凍存管在升溫時出現爆裂等情況，可以在放入水浴前就把超凈臺里的蓋子擰松一下然后再擰上;

  3. 水浴溫度37℃左右。

  一、凍存和復蘇的原則：慢凍快融

  當細胞冷到零度以下，可以產生以下變化：細胞器脫水，細胞中可溶性物質濃度升高，并在細胞內形成冰晶。

  如果緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內不會產生大的冰晶;如果快速冷凍的話，細胞內就會產生大的冰晶，大結晶會造成細胞膜、綱胞器的損傷和破裂。復蘇過程應快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結晶。

  二、慢凍程序

  1. 標準程序：采用細胞凍存器

  當溫度在-25 ℃以上時，1~2 ℃/min;

  當溫度達-25 ℃以下時，5~10 ℃/min;

  當溫度達-100℃時，可迅速放入液氮中。

  2. 簡易程序：將冷凍管(管口要朝上)放入紗布袋內，紗布袋系以線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降1~2 ℃的速度，在40 min內降至液氮表面過夜，次日早晨投人液氮中。

  3. 傳統程序：冷凍管置于4℃ 10 分鐘→ -20℃ 30 分鐘→ -80℃ 16~18 小時(或隔夜) → 液氮槽長期儲存。

  三、低溫保護劑的應用

  在細胞凍存時加入溫保護劑，能大大提高凍存效果。

  常用的低溫保護劑是DMSO，它是一種滲透性保護劑，可迅速透入細胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結過程，能使細胞內水分在凍結前透出細胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內冰晶，從而減少冰晶對細胞的損傷。

  四、細胞凍存方法

  1. 預先配制凍存液

  (1)10%DMSO + 細胞生長液(20%血清+基礎培養液)

  (2)10%甘油+ 細胞生長液(20%血清+基礎培養液)

  2. 取對數生長期細胞，經胰酶消化后，加入適量凍存液， 用吸管吹打制成細胞懸液(1×106 ~ 5 ×106細胞/ml)。

  3. 加入1 ml細胞于凍存管中，密封后標記冷凍細胞名稱和冷凍日期。液氮長期保存。

  五、保存細胞的復蘇方法

  1. 快速解凍

  凍存細胞從液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，輕輕搖動冷凍管，使其在1 分鐘內全部融化(不要超過3 分鐘)。

  2. 解凍后的細胞可直接接種到生長培養液的細胞培養瓶中直接進行培養，24小時后再用新鮮培養液替換舊培養液，以去除DMSO。

  3. 如果細胞對冷凍保護劑特別敏感

  解凍后的細胞應先通過離心去除冷凍保護劑，然后再接種到生長培養液的培養瓶中。

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