Ⅱ型膠原蛋白抗體免疫組化試劑盒樣本要求及實驗操作步驟

  樣本要求：新鮮活檢樣本組織，中性福爾馬林或多聚甲醛，固定時間 12-48h，參照病理技術規范要求取材、脫水、石蠟包埋并制成蠟塊，蠟塊在常溫條件下保存有效期有 5 年。組織切片厚度為 3-5μm 并黏

  附在防脫玻片上，輕拍切片架并用吸水紙吸干組織切片中的水滴，再放入 56-60℃恒溫箱中烘烤 2h 后，從恒溫箱中移出玻片放在溫室下冷卻。如果切片在室溫下(15-28℃)保存，為了良好的重現組織中的抗原分布情況，請于切片制作后 7 天內完成檢測。

  Ⅱ型膠原蛋白抗體免疫組化試劑盒

  實驗操作步驟(以石蠟切片為例)

  儀器、設備：

  移液槍、免疫組化筆、水浴鍋、計時器、孵育濕盒、切片架、蓋玻片、光學顯微鏡、洗瓶等。

  操作步驟

  1.脫蠟水化。將石蠟切片置于新鮮二甲苯脫中浸泡 15 分鐘，重復三次。去除多余的液體后，依次置于無水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇，各浸泡 5 分鐘，蒸餾水(或自來水)沖洗 5 分鐘。用 PBS 緩沖液(試劑 1，將干粉溶解于 2L 去離子水中)沖洗切片 5 分鐘，重復三次。

  2.抗原修復。將脫蠟水化后的組織切片置于燒杯(或修復盒)中的耐高溫塑料切片架上，加適量修復液 1× 檸檬酸鈉抗原修復液(試劑 2，將 100×檸檬酸鈉抗原修復液加去離子水稀釋成 1×檸檬酸鈉抗原修復液)，液面要浸過切片組織一定高度，將修復盒置于沸水中煮沸修復 15 分鐘后取出玻片，自然涼至室溫。用 PBS 緩沖液沖洗切片 5 分鐘，重復三次。

  注意：抗原修復時，修復液務必保證切片始終浸泡在液體內，一般情況：修復液的量約為 800mL/1 架。

  3.阻斷內源性過氧化物酶。用吸水紙擦干玻片，免疫組化筆在組織周圍畫圈，滴加 50μL 內源性過氧化物酶阻斷劑(試劑 3)到切片組織上以阻斷內源性過氧化物酶，室溫孵育 30 分鐘，用 PBS 緩沖液沖洗切片 5 分鐘，重復三次。

  4.血清封閉。用吸水紙擦干玻片，滴加 50μL 正常山羊血清工作液(試劑 5)，37℃封閉 20 分鐘，以減少非

  特異性染色。

  5.一抗孵育。用抗體稀釋液(試劑 4)將一抗原液稀釋成工作液，用吸水紙擦干玻片組織周圍的液體，滴加適量抗體工作液，置于濕盒 4℃孵育過夜或 37℃孵育 1h-2h。

  6.復溫。4℃過夜后從冰箱拿出樣本，在室溫下孵育 15min 復溫(抗體孵育為 4℃過夜選用此步驟，如室溫孵育直接進入下一步清洗)。用 PBS 緩沖液沖洗切片 5 分鐘，重復三次。

  7.二抗孵育。吸水紙擦干切片后滴加 50μL 生物素標記的羊抗兔 IgG(試劑 6)，37℃孵育 20 分鐘，用 PBS

  緩沖液沖洗切片 5 分鐘，重復三次。

  8.三抗孵育。吸水紙擦干切片后滴加 50μL 辣根酶標記的鏈酶卵白素孵育(試劑 7)，37℃孵育 20 分鐘，用 PBS 緩沖液沖洗切片 5 分鐘，重復三次。

  9. 顯色。甩去 PBS 緩沖液，吸水紙擦干切片; 每張切片滴加新鮮配制的 DAB 工作液 50 μL

  (試劑 8：試劑 9：試劑 1=1:1:18 比例配置)，孵育 3-5min，光學顯微鏡下觀察染色結果，切勿顯色過深;顯色后用自來水沖洗切片終止顯色。

  10.復染。滴加適量蘇木素染液(試劑 10)復染，孵育 1-5 分鐘，自來水沖洗 5 分鐘，滴加鹽酸酒精分化液分化 30 秒，自來水沖洗。

  11.脫水封片。將玻片依次置于 70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、無水乙醇，各浸泡 5 分鐘， 再將玻片放入二甲苯中浸泡 15 分鐘，重復三次。玻片取出來稍晾干，用中性樹膠封片。

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