ELISA實驗：操作常見問題及解決方案

  一、為什么所有試劑和檢測樣本要平衡至室溫后再進行加樣操作?

  溫度是ELISA結(jié)合反應(yīng)的重要影響因素。為了使所有樣本在一致的溫度下反應(yīng)，實驗前務(wù)必將所有試劑平衡至室溫，包括檢測樣本。避免因溫度的動力學(xué)反應(yīng)差異而導(dǎo)致ELISA檢測結(jié)果的不準(zhǔn)確。

  二、如何獲得良好線性的標(biāo)準(zhǔn)曲線?

  按照推薦方式保存標(biāo)準(zhǔn)品;溶解標(biāo)準(zhǔn)品之前需短暫離心，徹底收集粉末;確保標(biāo)準(zhǔn)品完全溶解和混勻(大約10min)，然后再進行后續(xù)的系列稀釋步驟，確保每一步都充分混勻且移液;顯色的恰當(dāng)終止;選擇合適的數(shù)學(xué)擬合方程繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

  三、ELISA實驗為什么必須設(shè)置復(fù)孔?

  為獲得準(zhǔn)確的實驗結(jié)果，強烈建議標(biāo)準(zhǔn)品及樣本進行復(fù)孔檢測。因為復(fù)孔檢測可以：

  計算平均值，確保實驗結(jié)果準(zhǔn)確;

  解決實驗中誤操作造成的跳孔現(xiàn)象;

  計算CV值，對實驗的操作和試劑盒的度進行評估。

  四、為什么實驗過程中孵育、洗滌需要振蕩?如何振蕩?

  振蕩孵育使反應(yīng)充分，振蕩洗滌使背景干凈。建議使用酶標(biāo)專用96孔微孔板振蕩器。

  孵育過程振蕩，可以加快、加強抗原抗體分子間的相互碰撞接觸，使得反應(yīng)過程加完全，OD值通常會比未振蕩孵育的結(jié)果要高;洗滌過程振蕩，可以使洗板干凈，在很大程度上 能降低背景值，同時可以提高試劑盒檢測的靈敏度。

  五、何時終止ELISA反應(yīng)?

  ELISA實驗終需要酶催化底物顯色反應(yīng)來完成，在佳時間終止反應(yīng)是ELISA實驗成功的重要因素。在HRP-TMB酶促反應(yīng)系統(tǒng)中，S5出現(xiàn)淡藍色，S1 – S3有明顯的階梯型藍色，便需要終止反應(yīng);或者根據(jù)高濃度標(biāo)準(zhǔn)品孔在620nm的OD值來決定，OD620=0.9-0.95之間時即可終止。

  六、為什么酶標(biāo)儀讀數(shù)時必須選用雙波長?

  首先，酶標(biāo)儀使用前務(wù)必預(yù)熱10-15min，使測讀結(jié)果穩(wěn)定。其次，ELISA實驗采用雙波長測定吸光度，可以排除單波長檢測時的測定干擾(標(biāo)本的濃度，干擾色等)。一般采用大波長作為參照波長，在參照波長下，檢測物的吸光值小，檢測波長和參照波長的吸光值之差可以消除非特異性吸收;因此，雙波長測定，可大限度的消除指紋、雜質(zhì)及不透光的物質(zhì)對酶標(biāo)儀讀數(shù)帶來的誤差，以保證實驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度。

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