本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物土霉素將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭土霉素抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物土霉素的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較可得出相應(yīng)殘留物土霉素的含量。

南京帕爾斯生物科技有限公司是一家專業(yè)經(jīng)營生物、儀器、試劑耗材的公司，在廣大用戶的幫助和支持下，經(jīng)過不懈的努力，已成為國內(nèi)生命科學(xué)領(lǐng)域產(chǎn)品的主要供應(yīng)商之一，代理許多國際先進(jìn)水平的高科技產(chǎn)品，包括分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、診斷等多個(gè)研究及應(yīng)用領(lǐng)域。公司的服務(wù)和業(yè)務(wù)網(wǎng)絡(luò)遍及全國，在同行獲得一致好評(píng)。

【 所用儀器、試劑】

具備的儀器：酶標(biāo)儀、均質(zhì)器、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量0.01g）、氮 吹儀、刻度移液管

微量移液器：單道 20μl～200μl、單道100μl～1000μl、多道 30～300 μl

試           劑： 甲醇、正己烷、Na₂HPO₄·12H₂O、NaOHNaH₂PO₄·2H₂O、NaCl

【實(shí)驗(yàn)前溶液配制】

配液1、20mM PBS緩沖液5.16gNa2HPO4*12H2O；0.87gNaH2PO4*2H2O;8.5gNaCl；加入蒸餾水至1000ml；用于樣品提取液

的配制。

配液2、樣品提取液的配制取1ml甲醇與9ml的20mMPBS緩沖液混勻。

配液3、 將2X濃縮復(fù)溶液用去離子水按1：1稀釋。(1份濃縮復(fù)溶掖+1份去離子水，用于抗體的稀釋和樣本提取后的復(fù)溶)。

配液4、將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照 1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按 所需用量配制洗滌液。

【樣本前處理步驟】

u 樣本處理前須知

（a）實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時(shí)要更換吸頭。

（b）實(shí)驗(yàn)之前須檢查各種實(shí)驗(yàn)器具是否干凈，必要時(shí)可對(duì)實(shí)驗(yàn)器具 進(jìn)行清潔，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

u 樣本處理：

（a）組織樣本前處理方法（不用過柱）

1、 稱取1±0.05g 均質(zhì)后的樣本于離心管中，加入4ml樣品提取液，振蕩5min，室溫4000r/min 以上，離心10min；

2、 取1ml上清液收集于另一試管中;加入1ml 正己烷,振蕩1min，室溫4000r/min 以上，離心10min；

3、 取50 μl下層液體于另一容器中，加入200μl樣本稀釋液混合30s；

4、 取50 μl 用于分析

    樣本稀釋倍數(shù): 20 倍

（b）蜂蜜處理方法

1、 準(zhǔn)確稱取1±0.05g 蜂蜜樣本于離心管中，加入4ml 樣品提 取液，強(qiáng)烈混合振蕩5min，室溫 4000r/min以上，離心10min；

2、 取出50μl 上清液于另一試管中，加入450μl樣本稀釋混合30s；

3、 取50 μl 用于分析

樣本稀釋倍數(shù): 40 倍

（c）牛奶樣品處理方法

脫脂牛奶

1、取出50μl 脫脂牛奶與1950μl樣本稀釋液，混30s；

2、取50 μl 用于分析

脂肪奶

3、吸取1ml 牛奶樣本于離心管中；于15℃環(huán)境3000r/min，離心10min；（如果沒有冷凍離心機(jī)請(qǐng)預(yù)先冷卻后再離心)

4、取出50μl 牛奶于與1950μl樣本稀釋液，混合30s；

5、取50 μl 用于分析

   樣本稀釋倍數(shù): 40 倍

【 酶標(biāo)免疫分析程序】

u 操作步驟：

1、    將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置室溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、   按板架及需要取出微孔條，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、   編號(hào)：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

4、    加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50μl /孔，再加入抗體工作液50μl/孔。輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板，25℃環(huán)境反應(yīng)30min。

5、    取出用洗滌液按每孔250μl洗板4-5次，每次浸泡15-30秒，拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6、    每孔加入酶標(biāo)記物100μl，蓋板膜蓋板后置25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。重復(fù)步驟5。

7、    顯色：每孔加入底物液A液50μl再加B液50μl，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境避光顯色15min。

8、   測(cè)定：每孔加入終止液50μl，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測(cè)在5min內(nèi)讀完數(shù)

        據(jù)），測(cè)定吸光度值（OD值）。

【結(jié)果判定】

    結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與其所含土霉素的含量成負(fù)相關(guān)。

1、粗略判定：

    用樣品的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出樣本所含土霉素濃度范圍（ng/ml）。假設(shè)樣品1的吸光度值為0.313，樣品2的吸光度值為1.032，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為1.892；0.1ppb為1.501；0.3ppb為1.175； 0.9ppb為0.751；2.7ppb為0.421；8.1ppb為0.198。則樣品1的濃度范圍是2.7ppb-8.1ppb；樣品2的濃度范圍是0.3ppb-0.9ppb。乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中土霉素實(shí)際濃度。           

2、定量分析：

所獲得的每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值（B₀）再乘以，即百分吸光度值。

百分吸光度值（%）＝	B	×
	B0

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以土霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/ml）的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中土霉素實(shí)際濃度。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣品的準(zhǔn)確、快速分析。

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