禽流感病毒
禽流感病毒
禽流感病毒
禽流感病毒H5亞型血凝抑制試驗(yàn)抗原與陰、陽(yáng)性血清
禽流感病毒H5亞型血凝抑制試驗(yàn)抗原與陰、陽(yáng)性血清
英文名 Avian Influenza Virus(H5 Sub-type) Hemagglutination Inhibition Test Antignen and Negative,Positive Sera 漢語(yǔ)拼音 Qinliugan Bingdu H5 Yaxing Xueningyizhishiyan Kangyuan Yu Yin,Yangxing Xueqing
【主要成分與含量】
抗原為滅活的H5亞型禽流感病毒，血凝效價(jià)≥7log2。陽(yáng)性血清為SPF雞感染禽流感病毒H5亞型制備的高免血清，HI效價(jià)≥7log2。陰性血清為SPF雞血清。
【性狀】 抗原為白色或淡黃色海綿狀疏松團(tuán)塊；陽(yáng)性血清和陰性血清為微黃色或淡紅色海綿狀疏松團(tuán)塊。易與瓶壁脫離，加稀釋液后迅速溶解。
【作用與用途】 用于HI試驗(yàn)檢測(cè)禽流感病毒H5亞型抗體。
【用法與判定】
1 材料
1.1 96孔V型(90度)微量反應(yīng)板、單道及多道微量移液器（配有吸頭）、加樣槽、吸管、燒杯等。
1.2 pH值7.2 0.01mol/L PBS
1.2.1 配制25倍PB 稱量2.74g Na2HPO4 和0.79g NaH2PO。H2O，加蒸餾水至100mL；
1.2.2 配制1倍PBS 量取40ml 25倍PB，加入8.5g NaCl，加蒸餾水至1000mL；
1.2.3 用NaOH或HCl調(diào)pH值至7.2；
1.2.4 69Kpa 15min高壓滅菌或用微孔濾膜過(guò)濾除菌。
1.2.5 PBS一經(jīng)使用，于2～8℃保存不超過(guò)3周。
1.3 阿氏（Alsevers）液 稱葡萄糖2.05g、檸檬酸鈉0.8g、檸檬酸0.055g、氯化鈉0.42g，加蒸餾水至100mL，加熱溶解后調(diào)pH值至6.1，69Kpa 15min高壓滅菌，2～8℃保存?zhèn)溆谩?
1.4 1%雞紅細(xì)胞懸液 采集2～3只SPF公雞或無(wú)禽流感和新城疫等抗體的健康公雞的血液與等體積阿氏液混合，用pH值7.2 0.01mol/L PBS液洗滌3次，每次均以3000rpm/min離心5min，洗滌后用PBS配成1%（V/V）紅細(xì)胞懸液，2～8℃保存?zhèn)溆谩?
1.5 抗原溶解 凍干的抗原和血清均按瓶簽上規(guī)格標(biāo)注的量，用PBS溶解。
2 操作術(shù)式
2.1 血凝（HA）試驗(yàn)
2.1.1 在V型微量反應(yīng)板中，每孔加0.025ml PBS。
2.1.2 第l孔加0.025ml抗原，反復(fù)抽打3～5次混勻。
2.1.3 從第1孔吸取0.025ml抗原加入第2孔，混勻后吸取0.025ml加入第3孔，如此進(jìn)行對(duì)倍稀釋至第11孔，從第11孔吸取0.025mL棄去。
2.1.4 每孔加0.025mL PBS。
2.1.5 每孔加入0.025mL 1%（V/V）雞紅細(xì)胞懸液。
2.1.6 將反應(yīng)板在振蕩器上震蕩1～2分鐘或輕扣反應(yīng)板混合反應(yīng)物，在室溫（20～25℃）下靜置20～30分鐘或2～8℃ 45～60分鐘。在對(duì)照孔紅細(xì)胞顯著呈鈕扣狀時(shí)判定結(jié)果。
2.1.7 結(jié)果判定 將反應(yīng)板傾斜60度，觀察紅細(xì)胞有無(wú)淚珠狀流淌，完全無(wú)淚珠樣流淌(凝集)的zui高稀釋倍數(shù)為血凝效價(jià)。
2.2 血凝抑制（HI）試驗(yàn)
2.2.1 根據(jù)HA試驗(yàn)測(cè)定的效價(jià)，計(jì)算配制4個(gè)血凝單位(4HAU)抗原。HA效價(jià)除以4即為含4HAU抗原的稀釋倍數(shù)。例如，HA效價(jià)為1:256，則4HAU抗原的稀釋倍數(shù)應(yīng)是1:64（256除以4）。
2.2.2 第1～11孔加入0.025mL PBS，第12孔加入0.05mL PBS。
2.2.3 第1孔加入0.025mL血清，充分混勻后吸0.025mL于第2孔，依次對(duì)倍稀釋至第10孔，從第10孔吸取0.025mL棄去。
2.2.4 第1～11孔均加入0.025mL的4HAU抗原，在室溫（20～25℃）下靜置30分鐘或2～8℃ 50分鐘。
2.2.5 每孔加入0.025mL 1%（V/V）的雞紅細(xì)胞懸液，震蕩混勻，在室溫（20～25℃）下靜置20～30分鐘或2～8℃ 45～60分鐘，對(duì)照紅細(xì)胞將呈明顯鈕扣狀沉于孔底。
3 結(jié)果判定
以完全抑制4 HAU抗原的zui高血清稀釋倍數(shù)判為該血清的HI效價(jià)。當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照血清的HI效價(jià)與已知效價(jià)誤差不超過(guò)1個(gè)滴度，陰性對(duì)照血清效價(jià)不高于21og2時(shí)，試驗(yàn)方可成立。被檢血清HI效價(jià)≤31og2判為陰性；＝41og2判為可疑(可疑樣品應(yīng)重檢，重檢效價(jià)≥41og2判為陽(yáng)性，≤31og2判為陰性)；≥51og2判為陽(yáng)性.
【注意事項(xiàng)】
（1）HA和HI試驗(yàn)影響因素甚多，應(yīng)嚴(yán)格控制試驗(yàn)條件。每加一試劑或樣品后需更換吸頭，同時(shí)應(yīng)嚴(yán)格控制作用溫度和時(shí)間。
（2）準(zhǔn)確配制紅細(xì)胞懸液，使用時(shí)應(yīng)隨時(shí)振搖。（3）用pH值7.0～7.2的PBS作為稀釋液。
（4）抗原和陰、陽(yáng)性血清若有污染，應(yīng)廢棄。
（5）準(zhǔn)確配制4HAU抗原，使用前需進(jìn)行滴定，滴定好的抗原應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)用完。
（6）抗原和血清按規(guī)定保存。凍干試劑應(yīng)按規(guī)定的體積用PBS溶解。溶解后2～8℃保存不超過(guò)1個(gè)月；可分裝成小包裝，-70℃凍存，隨用隨取。切忌反復(fù)凍融。
（7）鴨、鵝以及哺乳動(dòng)物的血清一般需進(jìn)行非特異性凝集和抑制素的處理。
（8）同一亞型不同毒株的HI試驗(yàn)抗原，若抗原性存在差異，則檢測(cè)同一血清的HI效價(jià)不同。
【廢棄包裝處理措施】
剩余的試劑及空瓶不能隨意丟棄，須經(jīng)加熱或消毒滅菌后方可廢棄。
【規(guī)格】
（1）1ml/瓶
（2）2ml/瓶
【包裝】 10瓶/盒、24盒/箱。
【貯藏與有效期】
-15℃以下保存，有效期為24個(gè)月。
【批準(zhǔn)文號(hào)】
獸藥生字（2006）080018076
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