本試劑盒是一種利用熒光探針O52進行活性氮檢測的試劑盒。在活性氮存在的條件下，O52探針與活性氮反應生成強熒光物質O52F，O52F發出的綠色熒光強度與組織內活性氮水平成正比，檢測O52F的熒光就可以知道組織內活性氮的水平。O52F的熒光最大激發波長是490nm，最大發射波長是516nm。

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樣本類型：

● 新鮮組織

試劑盒以外自備儀器和試劑耗材：

● 熒光分光光度計或酶標儀 ● 離心機 ● PBS緩沖液/HBSS（無酚紅） ● 蛋白定量試劑盒

● 熒光測定專用的黑色96孔板

使用注意事項：

● 螺旋蓋微量管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內壁上的液體收集至管底，避免開蓋時液體灑落。

● O52染色液為DMSO溶液，冬季氣溫較低時在室溫時為凝固狀態，極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱溶解，吸頭也需要放在培養箱預熱，否者容易再次凝固在吸頭內壁產生損耗。

● 使用前，先將本品取出回溫至室溫，并對其進行簡短離心使DMSO溶液集中于管底。

● 盡量縮短探針標記后到測定所用的時間，以減少各種可能的誤差。

使用方法：

試劑準備：

根據樣本數量，用純水將O52探針10倍稀釋，配制成探針工作液。充分混勻，備用。

【注】：

● 不可以一次性將探針全部稀釋。

● 現配現用。

● O52染色液為DMSO溶液，冬季氣溫較低時在室溫時為凝固狀態，極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱溶解，吸頭也需要放在培養箱預熱，否者容易再次凝固在吸頭內壁產生損耗。

● 微量操作時，注意探針要有效加入稀釋液中，避免沒有加入。

● 以下步驟使用的探針為此步驟配制好的探針工作液。

樣本處理：

1、剛取得的新鮮組織樣本用PBS洗凈。

2、準確稱取50mg或100mg組織樣本，加入500μL-1 mL勻漿緩沖液A，用勻漿機/勻漿器充分勻漿。。

樣本檢測：

1、在96孔板中加入190μL勻漿上清液、10μL O52探針，用移液器吹打，使之充分混勻。

【注】：

● 不同樣本的活性氧差異較大，需要根據預實驗結果調整探針用量。一般加入2-10μL探針，染色終濃度按試劑盒中探針母液的200-1000倍稀釋，200倍稀釋適合大多數樣本。

● 如果熒光強度太強，超過了檢測儀器的量程，可以減少探針用量。保證所有樣本探針用量一致即可。

● 此步加入的是經過稀釋配制的探針工作液。

● 以酶標儀檢測為例。也可以用熒光分光光度計檢測，根據所使用儀器決定勻漿液體積和染色容器。。

2、在37℃避光孵育30分鐘。

3、置于酶標儀中，后于激發波長為488nm、發射波長530nm檢測熒光強度。

【注】：

● 或使用熒光光度計等其它熒光檢測設備。

● 必須使用熒光檢測專用的黑色96孔板。

● 如果熒光強度太強，超過了儀器的檢測范圍，可以將孵育后的勻漿上清液用純水稀釋后再檢測。一般稀釋5-50倍。保證所有樣本稀釋倍數一致即可。

蛋白定量：

1、另取50μL上清勻漿液，用PBS大約稀釋20-30倍。

2、取100μL進行蛋白定量，測定蛋白濃度（mg/mL）。

結果處理：

以熒光強度（RFU）/蛋白濃度（毫克蛋白）表示組織活性氮強度。

【注】：

● 數據與蛋白濃度的單位無關。

● 此處以蛋白濃度數據作為校正系數，對不同樣品進行均一化處理。

● 熒光強度強則活性氮（RNS）含量高。

● 可以用實驗中對照樣本的熒光強度值為基準，待測組樣本的熒光強度值占對照樣本的百分比來比較活性氮（RNS）程度差異。

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