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價格：電議
所在地：北京
型號：HR8092-50T
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更新時間：2023-05-31
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公司地址：北京市海淀區紫雀路33號院3號樓
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王欣(女士) （來電時請說是從給覽網看到我的)
產品特點：
● 使用方便。
● 含蛋白穩定劑，提取的蛋白穩定。
● 紫外檢測蛋白濃度時，背景干擾低。
● 蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制劑配方優化。蛋白酶抑制劑混合物包含6種獨立的蛋白酶抑制劑；每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性。該混合物優化的組成使其可以抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性，包括絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。
試劑盒以外自備試劑和儀器：
● 離心機 ● 渦旋混勻器 ● 振蕩器 ● 勻漿機/勻漿器 ● PBS ● 蛋白定量試劑盒
使用注意事項：
● 旋帽離心管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內壁上的液體甩至管底，避免開蓋時液體灑落。
● 實驗過程中的所有試劑須預冷；所有器具須放-20℃冰箱預冷。整個過程須保持樣品處于低溫。
● 蛋白酶抑制劑儲存期間溶液如果出現沉淀，不影響使用，溶解后正常使用。
● 可以根據自己實驗需要加入其它蛋白酶抑制劑單品。
● 提取液A在使用前須一直置于2-8℃條件，否則下游膜蛋白提取時會導致不容易分層。
● 膜蛋白電泳時loading buffer應該避免煮沸。
● 膜蛋白電泳時可以提高loading buffer的SDS含量。
使用方法：
1、提取液準備：
每500μL冷的提取液A和C中各加入1μL蛋白酶抑制劑混合物，充分混勻后置冰上備用。
【注】：
● 根據需要處理的樣品數量準備蛋白提取液，蛋白酶抑制劑混合物不可以一次全部加入提取液。
● 加過蛋白酶抑制劑的提取液一周內未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制劑。
● 以下步驟中使用的蛋白提取液為此步配制好的含蛋白酶抑制劑的提取液。
2、收集50-200mg真菌樣本，用PBS洗2次，在4℃，5000×g條件下離心5分鐘，小心吸取PBS，盡可能吸干，收集菌體。
【注】：
● 細胞數量根據實驗情況調整，每次的裂解液用量并不是一定的，請根據實際情況調整。
● 由于膜蛋白含量較少，需要較多的細胞才能保證得率。在條件允許的情況下，盡可能加大細胞上樣量。
3、加入500μL冷的提取液A后用勻漿機/勻漿器充分勻漿。
【注】：
● 也可置于研缽中用液氮研磨，研磨后加入500μL冷的提取液A。
● 沒有液氮研磨條件，也可加入500μL 提取液A直接置冰上研磨。
● 提取液A在使用前須一直置于2-8℃條件，否則下游膜蛋白提取時會導致不容易分層。
4、在2-8℃低溫條件下持續振蕩1-2小時。
【注】：
● 此步驟必須在2-8℃條件振蕩。
● 使用振蕩器/搖床的較低轉速，提取液能輕微晃動即可。
● 沒有2-8℃振蕩條件也可以不振蕩，置2-8℃靜置，稍微延長提取液的處理時間，中間每隔幾分鐘用移液器吹打混勻即可。
5、將提取液在2-8℃下10000×g離心5分鐘，取上清。
6、在上清中加入5μL抽提液B，充分混勻。
7、在37℃水浴10分鐘。
8、在37℃條件下1000×g離心5分鐘。
【注】：
● 此步驟必須37℃條件下離心。
● 如果離心機不可控溫，可以不離心，延長上一步驟水浴時間，至溶液逐漸澄清，分層清晰即可。或者在室溫條件下離心，縮短離心時間至1分鐘。
9、此時溶液分為2層，小心移除上層，留下下層管底部大約50μL液體。
【注】：
● 下層為粘稠狀液體。
● 有時還沒有分層完全時看上去可能像3層，保留中間的界面層即可。
10、用1-2倍體積冷的膜蛋白溶解液C溶解該溶液，即得膜蛋白樣品。
【注】：
● 膜蛋白比較難溶解，不能很快溶解混勻，可以在加入溶解液后稍微吹打混勻，然后置于4℃冰箱靜置至溶解。中途用移液器輕輕吹打混勻一次。靜置后取出再次用移液器稍微吹打混勻即可。
● 靜置直至管底透明膠狀物完全溶解。
11、將上述蛋白提取物定量后分裝于-80℃冰箱保存備用或直接用于下游實驗。
【注】：
● 建議用BCA法進行蛋白定量。相關產品：HR0329。
● 蛋白樣品-80℃存放一年沒有問題。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被細菌污染。
常見問題分析：
● 蛋白濃度低？
膜蛋白豐度較低，需要盡可能真菌上樣量。處理部分組織樣本時可能沒有裂解完全，導致蛋白濃度低。只要適當延長試劑A的處理時間即可。最好在持續振蕩的條件下處理，沒有振蕩器也可間隔幾分鐘用吸頭吹打混勻。
● 用什么方法定量蛋白？
建議用BCA法。不適合用Bradford法，因為試劑A中含有干擾Bradford法的組份，導致定量不準。如果已經進行過透析處理或者用脫鹽柱改換過緩沖體系，則可以用Bradford法定量。
● 提取的蛋白具有活性嗎？
本試劑盒不含有離子型去垢劑組份，不破壞蛋白的結構，沒有對蛋白質之間原有的相互作用的破壞，蛋白均保持其天然構象和活性。
● 膜蛋白電泳沒有條帶？
膜蛋白樣品通常濃度較低，電泳前一定要進行蛋白定量，以保證電泳是蛋白上樣量足夠。
膜蛋白提取好后，用溶解液充分溶解后，可以超聲處理一下，再進行蛋白定量。
蛋白加Loading buffer后可以不用煮沸，采用50℃保溫30分鐘。
蛋白Loading buffer中SDS終濃度含量可以提高至3%-10%。
有些樣品的膜蛋白含量太低，可以使用丙酮沉淀膜蛋白，再使膜蛋白溶解于上樣緩沖液中，一般可以跑出清晰的蛋白條帶。
電泳時最后采用低電壓低電流電泳。
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