線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(TMRE法)TMRE比羅丹明123更快地穿過(guò)質(zhì)膜,并且它們的強(qiáng)熒光允許使用低探針濃度,從而避免聚集。由于它們的熒光對(duì)環(huán)境相對(duì)不敏感,因此TMRE的空間分辨熒光呈現(xiàn)其跨膜分布的無(wú)偏分布,TMRE已成功用于高分辨率對(duì)于影響活細(xì)胞中線粒體膜電位的藥物的高通量篩選測(cè)定。

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線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(TMRE法)

 

產(chǎn)品編號(hào)：HR8272

產(chǎn)品組成：

儲(chǔ)存條件：

TMRE -20℃避光保存,避免反復(fù)凍融。稀釋液2-8℃保存。有效期6個(gè)月。

【注】：

● TMRE染色液需要長(zhǎng)期保存時(shí)可以根據(jù)使用情況進(jìn)行小量分裝后-20℃保存。

● 染色液A為DMSO溶液,冬季氣溫較低時(shí)為凝固狀態(tài),極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱融解,變成液體狀態(tài)后離心至管底部再開(kāi)蓋。

● 可以用手捂住使其融解或37℃短時(shí)間水浴。吸頭也需要放在培養(yǎng)箱預(yù)熱,否者容易再次凝固在吸頭內(nèi)壁產(chǎn)生損耗。

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(TMRE)是利用TMRE探針檢測(cè)線粒體膜電位的試劑盒,可以快速靈敏地檢測(cè)細(xì)胞、組織或純化的線粒體膜電位變化,可以用于早期的細(xì)胞凋亡檢測(cè)。

線粒體膜電位下降是細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)標(biāo)志性事件。TMRE是一種可通透細(xì)胞膜的選擇性染色活細(xì)胞線粒體的熒光染料,廣泛用作檢測(cè)線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential)的熒光探針。TMRE是陽(yáng)離子熒光染料,在正常細(xì)胞中能夠依賴線粒體跨膜電位進(jìn)入線粒體基質(zhì)。在細(xì)胞凋亡發(fā)生時(shí),線粒體膜完整性破壞,線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔開(kāi)放,引起線粒體跨膜電位(ΔΨm)的崩潰,TMRE重新釋放出線粒體。通過(guò)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱來(lái)檢測(cè)線粒體膜電位的變化,可用于培養(yǎng)的細(xì)胞或從組織中提取出的線粒體的膜電位檢測(cè)。

四甲基羅丹明乙基酯(TMRE)在線粒體中的積累被證明是由它們的膜電位驅(qū)動(dòng)的。此外,由于它們的疏水特性降低,這些探針對(duì)細(xì)胞表現(xiàn)出與羅丹明6G相比低10-20倍的電位非依賴性結(jié)合。四甲基羅丹明乙酯為動(dòng)態(tài)和最佳原位定量測(cè)量熒光染料之一,比羅丹明123更好 ,因?yàn)槠浔换罴?xì)胞快速和可逆地吸收。

TMRE比羅丹明123更快地穿過(guò)質(zhì)膜,并且它們的強(qiáng)熒光允許使用低探針濃度,從而避免聚集。由于它們的熒光對(duì)環(huán)境相對(duì)不敏感,因此TMRE的空間分辨熒光呈現(xiàn)其跨膜分布的無(wú)偏分布,TMRE已成功用于高分辨率對(duì)于影響活細(xì)胞中線粒體膜電位的藥物的高通量篩選測(cè)定。

TMRE可以快速通過(guò)細(xì)胞膜,僅需幾分鐘就可以被具有活性的線粒體所俘獲,并且對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒性。TMRE的最大激發(fā)波長(zhǎng)為549nm,最大發(fā)射波長(zhǎng)為574nm。

檢測(cè)方法：

● 流式細(xì)胞儀 ● 熒光顯微鏡 ● 激光共聚焦 ● 熒光酶標(biāo)儀/光度計(jì)

樣本類型：

● 懸浮細(xì)胞 ● 貼壁細(xì)胞

試劑盒以外自備儀器和試劑耗材：

● 流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡或激光共聚焦 ● 離心機(jī) ● PBS或者HBSS(不含酚紅)

線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(TMRE法)使用注意事項(xiàng)：

● 旋帽離心管裝的試劑在開(kāi)蓋前請(qǐng)短暫離心,將蓋內(nèi)壁上的液體甩至管底,避免開(kāi)蓋時(shí)液體灑落。

● 細(xì)胞處理需要小心操作,盡量避免人為的損傷細(xì)胞。

● 始終保持平衡染液中pH值的一致性,因?yàn)閜H值的變化將影響膜電位。

● 根椐細(xì)胞種類、實(shí)驗(yàn)條件不同流式細(xì)胞儀設(shè)置不同。

● 線粒體膜電位降低,熒光強(qiáng)度減弱。但是結(jié)果分析時(shí)注意排除熒光淬滅現(xiàn)象,TMRE熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜有一部分是重合的,其發(fā)射光有一部分(與激發(fā)光重合的部分)會(huì)被自己重新吸收,而且這種吸收的效益隨著該熒光物質(zhì)的濃度增加而增強(qiáng)。換而言之,當(dāng)熒光物質(zhì)濃度很高的時(shí)候其熒光強(qiáng)度和濃度的增加不成正比,此時(shí)注意檢測(cè)結(jié)果的分析。采用JC-1法可以減少熒光淬滅的影響。

使用方法：

染色工作液的配制：

根據(jù)樣本數(shù)量,用37℃培養(yǎng)箱預(yù)熱染料稀釋液試劑B將TMRE熒光染料10倍稀釋。再用HBSS或相應(yīng)的無(wú)血清培養(yǎng)基或其他緩沖液將探針TMRE進(jìn)行40-200倍稀釋,配制成染色工作液。

【注】：

● 也可不用本試劑盒中的試劑B,直接用HBSS等緩沖液或相應(yīng)的無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋TMRE染料至所需濃度。

● 開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前,使用HBSS緩沖液或無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋染料儲(chǔ)存液到需要的工作濃度。工作濃度應(yīng)根據(jù)不同細(xì)胞的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定的最佳工作濃度,建議至少在超過(guò)10倍范圍的濃度下進(jìn)行測(cè)試。一般染色終濃度400-2000倍稀釋,1000-2000倍適合大多數(shù)細(xì)胞樣本。

● 建議收到產(chǎn)品后,根據(jù)單次使用量,對(duì)母液進(jìn)行小量分裝,每次使用一管,試劑-20℃避光凍存,一年穩(wěn)定。

● 工作液現(xiàn)配現(xiàn)用。

● 為了降低探針加載過(guò)度可能引起的假陽(yáng)性,建議在不影響染色效果的情況下盡量使用低濃度。

● 若細(xì)胞在染色后于不含染料的培養(yǎng)基中孵育,熒光信號(hào)會(huì)衰減。

線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(TMRE法)懸浮細(xì)胞：

1、收集樣本細(xì)胞以及陰性、陽(yáng)性對(duì)照細(xì)胞。

2、用PBS洗滌細(xì)胞兩次。離心收集細(xì)胞。

【注】：

● 300×g-500×g,2-8℃,離心時(shí)間5分鐘收集細(xì)胞。

3、用500μL TMRE染色工作液將細(xì)胞重懸,細(xì)胞密度約5-10×10⁵個(gè)/mL。37℃,5% CO₂的培養(yǎng)箱中孵育15分鐘。

4、常溫離心收集細(xì)胞。用PBS洗滌細(xì)胞2次。

【注】：

● 300×g-500×g,離心時(shí)間5分鐘收集細(xì)胞。

5、用 500μL預(yù)熱的1×染色緩沖液將細(xì)胞重懸。

6、用流式細(xì)胞儀/熒光酶標(biāo)儀/分光光度計(jì)檢測(cè)分析結(jié)果,或者用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果。

貼壁細(xì)胞：

對(duì)于貼壁細(xì)胞,可以先收集細(xì)胞,重懸后參考懸浮細(xì)胞的檢測(cè)方法。也可以直接原位染色后檢測(cè)。

純化線粒體：

1、把配制好的TMRE染色工作液再用TMRE稀釋液稀釋5倍。

2、0.9mL 5倍稀釋的TMRE染色工作液中加入0.1mL總蛋白量為10～100μg的純化的線粒體。

3、結(jié)果檢測(cè)。

組織樣本：

組織樣本可以用玻璃勻漿器勻漿成單細(xì)胞懸液后按照細(xì)胞樣本的方法檢測(cè)。也可以用其他細(xì)胞懸液制備的試劑盒處理組織后檢測(cè)。

結(jié)果分析：

檢測(cè)時(shí)可以把激發(fā)光設(shè)置為549nm,發(fā)射光設(shè)置為574nm。

線粒體膜電位降低,熒光強(qiáng)度減弱。

用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位的情況。

也可以用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察；用熒光分光光度計(jì)或熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)。

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